织金县玛瑙红樱桃褐腐病病原菌的鉴定

安星宇李海黄露李淳吴石平

(1.贵州省农业科学院植物保护研究所，贵州 贵阳 550006；2.织金县植保植检站，贵州 织金 552100)

樱桃(Prunus avium L.)果实色泽红艳，味道甘甜而微酸，深受消费者的喜爱。近年来，随着我国人民消费水平不断提高，樱桃消费量呈现快速增加的趋势[1]。樱桃最早起源于我国，已经有3000多年的栽培历史，目前广泛分布于我国西南及华北地区[2]，国内樱桃产量由2014年的3.45万t上升到2018年的80余万t，4a间增长超过20多倍，使得我国超越土耳其，成为世界第一大樱桃生产国[3]。贵州属于亚热带季风气候，非常适于喜高温、高湿的樱桃生长。目前，贵州省樱桃种植区主要分布在中部、西北部和北部，包括贵阳市、安顺市、毕节市和遵义市，樱桃作为特色果树产业，在贵州农业产业结构调整的大背景下，种植规模得到迅速扩大[4]。至2020年，全省樱桃总种植面积高达3.48万hm2，同比增长6.72%。然而随着樱桃种植面积的扩大，病虫害的危害程度也日益加重，其中危害樱桃叶、花、新梢、果实的褐腐病在贵州种植区发生严重，严重影响了当地樱桃的产量和品质，成为樱桃生产上的主要病害之一[5]。樱桃褐腐病又称菌核病、灰腐病等，是一种世界性病害，目前该病害在我国山东、江苏、陕西、浙江等地均有发生[6]。目前，我国所报道的樱桃褐腐病均由链核盘菌属(Monilinia spp.)侵染所引起，分别为核果链核盘菌(Monilinia laxa)、美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola)和果生链核盘菌(Monilinia fructigena)3个种[7]，三者侵染部位存在差异，但均能侵染果实，致使果树产量及品质受到影响[8]。大量研究发现，该病菌还可危害桃、杏、李、梅等核果类果树[9]。

“玛瑙红”是贵州省内最为畅销的樱桃品种，其是贵州本地选育而成的地方优良早熟品种，以其熟透的果子红中透紫，像晶莹剔透的红玛瑙而得名[10]。“玛瑙红”樱桃果形心脏形，紫红艳丽，风味佳，品质上乘，可溶性糖含量达到11.88%，每100g果肉中的维生素C含量更是高达22.578mg，凭借高含量的糖、酸、维生素C，享誉“中国南方樱桃之王”之称[11]。近年来，“玛瑙红”在毕节织金县、大方县、赫章县以万亩的速度推进种植，其中，织金县规模化种植面积达2666hm2以上，樱桃总产量更是逐年提升，为当地农业经济注入了新的活力。然而，褐腐病所引起的果实腐败已成为当地政府和果农亟需解决的重要问题。目前，相关科研者已对贵州樱桃病虫害发生的种类及危害现状进行了一定的调查研究，但贵州樱桃褐腐病的病菌分离鉴定未见报道，不能确定贵州樱桃褐腐病的病原菌种类。因此，本研究对贵州樱桃主产区织金县的褐腐病进行病菌分离、鉴定，明确了当地褐腐病病菌种类，为樱桃褐腐病的有效防控提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 感病样品

“玛瑙红”樱桃褐腐病病样于2020年5月采集于贵州省织金县樱桃种植园。

1.1.2 试验试剂及仪器

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、2×Bench TopTMTaq Master Mix(倍沃医学科技有限公司)、DNA marker D2000(天根生化科技有限公司)；离心机(赛默飞世尔科技公司)、PCR仪(美国伯乐公司)、DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.1.3 培养基

水琼脂培养基(WA)：将15g琼脂粉加入到1000mL蒸馏水中，自然pH，121℃下灭菌20min，倒入灭过菌的培养皿中，备用。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：将200g去皮的马铃薯切片，用蒸馏水煮沸，经纱布过滤后，定容至1000mL，加入18g琼脂粉以及18g葡萄糖，自然pH，121℃下灭菌20min，倒入灭过菌的培养皿中，备用。

1.1.4 引物

选用真菌内转录间隔区(internal transcribed sequence,ITS)通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增，该对引物由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离

在显微镜下观察病样，挑取褐腐病菌的分生孢子，加入到无菌水中，制成孢子悬浮液，然后将孢子悬浮液吸取至水琼脂平板上进行涂布。培养24h后，在显微镜下将已经萌发的孢子转接到PDA培养基上，25℃培养5～7d，最后进行纯化，并分别保存在4℃及-80℃冰箱中。

1.2.2 病原菌的鉴定

对分离纯化的病原菌进行形态学观察，记录其形态特征。通过CTAB法提取菌株DNA[12]，使用真菌通用引物ITS1和ITS4对菌株DNA的核糖体ITS序列进行扩增。25μL PCR反应体系：12.5μL 2×Bench TopTMTaq Master Mix、上下游引物各1μL、9.5μL ddH2O、1μL菌株DNA。PCR扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。参照崔晓霞等[13]分析方法，通过BioEide对分离菌株及参考菌株的ITS基因的序列分别进行编辑，然后用MEGA 6.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚类分析，依据菌株形态特征以及分子系统学结果对菌株进行准确鉴定。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离纯化

从图1a可知，樱桃褐腐病能够在叶部引起水渍状病斑，病斑中央为灰白色，边缘为褐色，边界明显。对樱桃样品进行病原菌分离，在显微镜下发现该病菌的分生孢子呈无色、单胞，形状为柠檬形或卵形，见图1b。通过单孢分离，共分离得到3个病原菌株，分别命名为ytys、ytys1、ytys4。

2.2 ITS序列测定与构建进化树

通过真菌ITS通用引物ITS1/ITS4对分离菌株进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。通过同源性比较和构建系统发育树，分离得到的菌株ytys、ytys1、ytys4与M.fructicola(登录号为KX982695、MH854789、MH854846、MH855692、MH860465、MH864497)聚于同一支，同源性达到了97%，见图2。结合其形态学特征，确定引起织金县“玛瑙红”樱桃褐腐病的菌株ytys、ytys1、ytys4为美澳型核果褐腐病菌M.fructicola。

3 讨论

近年来，随着分子系统学的快速发展，形态学观察结合分子系统学分析的鉴定方法在真菌鉴定中得到越来越多的应用[14]。本研究从具有典型褐腐病症状的病样分离得到病原菌，通过形态学观察和分子生物学技术鉴定，发现分离得到的菌株与M.fructicola高度同源，表明造成织金县“玛瑙红”樱桃褐腐病的主要病原菌为M.fructicola。目前，M.fructicola已在北京、浙江、云南、辽宁、甘肃等多地发现，其能侵染桃[15]、李[16]、樱桃[17]等蔷薇科果树，对各地水果生产造成了严重的威胁。本次是首次在贵州樱桃中鉴定出该病菌，鉴于其寄主广泛、危害严重等特点，应及时采取绿色高效的防治措施，科学使用低毒、低残留农药，加强对樱桃园的田间管理，并结合生物防治,有效地预防和控制褐腐病的发生。此外，还应加强防范其对当地蔷薇科果树的侵染，避免造成更大的经济损失。

随着电商平台的不断发展，织金县“玛瑙红”樱桃不断开拓市场，网络年销售高达8t。此外，织金县将玛瑙红樱桃产业和旅游产业相结合，形成了赏花和采摘2个旅游旺季，促进了当地经济发展，带领农民脱贫致富。为了有效保障当地樱桃产业的良好发展，对当地种植区樱桃病虫害发生的种类进行准确鉴定是十分必要的。本研究通过对贵州樱桃主产区织金县的褐腐病进行病菌分离、鉴定，明确了褐腐病病菌种类，为当地樱桃褐腐病的诊断及综合防控提供理论依据，从而更好地促进当地农业经济增长。