高海拔地区组培室消毒效果比较

珍 珍

(日喀则市农业科学研究所，西藏 日喀则 857000)

引言

马铃薯脱毒试管苗在生产上的应用解决了马铃薯病毒病危害造成减产的问题，但是目前微生物污染又成为脱毒试管苗生产的制约因素。因此，如何将污染控制到最低水平，并且将成本降到最低，成为目前组培实验室需要解决的重要问题。由于西藏地区环境温差大，气候干燥，每当换季交替之时常出现大量的组培苗污染情况，直接影响组培苗的质量。因此，西藏脱毒马铃薯组培实验室的消毒是实验室最重要工作之一，研究选择适合高海拔地区组培实验室的消毒剂，提高组培苗的质量成为目前高海拔地区组培实验室亟需解决的最重要的问题。目前，高海拔地区组培实验室常用的空气消毒方法有甲醛和高锰酸钾熏蒸、次氯酸钠擦拭、紫外灯照射等方法，近2a组培室常用的方法有二氧化氯消毒法。每种消毒方法都有一定的缺陷，但都能不同程度的对组培环境起到灭菌效果。如，紫外线具有一定的辐射，对人体皮肤会造成损害；次氯酸钠最后分解为氯气和氧气而散逸，因而易于除去，不留残毒，但产生的刺激性气体如氯气和氯化氢对人体有毒害作用，这些气体强烈刺激眼角膜、上呼吸道粘膜等，可引起喉痉孪、喉水肿、支气管炎和急性脑炎等；甲醛残存时间长，还可致癌[1]，皮肤直接接触甲醛可引起过敏性皮炎，产生色斑，吸入高浓度甲醛，可诱发过敏性哮喘[2]；各种空气灭菌器消毒灭菌效果各异，一次性投入大，使用成本高[3]。二氧化氯消毒剂是国际上公认的高效消毒灭菌剂，该消毒剂为无色、无特殊气味液体，pH值为6.5,二氧化氯浓度为0.501%。其可以杀灭一切微生物，包括细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、分枝杆菌、病毒等，并且这些细菌不会产生抗药性。二氧化氯对微生物细胞壁有较强的吸附穿透能力，可有效氧化细胞内含巯基的酶，还可以快速抑制微生物蛋白质的合成来破坏微生物。本研究目的是通过比较二氧化氯、甲醛、次氯酸钠在高海拔组培室的熏蒸消毒效果，找到一种适合高海拔组培室的消毒效果且成本低的组培室空气消毒方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料包括甲醛、次氯酸钠、二氧化氯、无菌培养皿等。

1.2 试验地点

试验地点为西藏日喀则市农业科学研究所薯类脱毒中心。

1.3 方法

1.3.1 熏蒸灭菌

试验在3间组培室进行，分别为次氯酸钠、二氧化氯、甲醛熏蒸(对照)。根据组培室的面积，次氯酸钠消毒剂含有效氯和表面活性剂，对细菌、芽孢、病毒、结核杆菌有较强的杀灭作用。经过次氯酸钠空气喷雾后，空气细菌含量显著下降，其是一种纯天然原料配制成的含氯消毒剂，能渗透各种有机物，快速杀灭多种细菌、病毒，作用快、效果好，是一种高效消毒剂。次氯酸钠为含氯消毒剂，高效广谱，为国内外广泛使用[4]。次氯酸钠溶液在300～500ppm，环境消毒时间约为30min左右，但次氯酸钠溶液有极强的腐蚀性。二氧化氯无色无味、无毒无残留，安全可靠，属于生态安全环保型消毒剂，杀菌效果显著，使用简单便捷，重要的是对操作人员的健康不会产生危害。根据组培室的面积，二氧化氯熏蒸按10mL B剂倒入含2片A剂玻璃容器中后放在高度1.5m左右的台子上后撤离，关闭门窗。甲醛为无色气体，易溶于水，40%甲醛的溶液称为福尔马林，有很强的还原作用和特殊刺激性气味。甲醛和高锰酸钾为2∶1浓度，按照甲醛(40%)410mL·m-3、高锰酸钾5g·m-3，将甲醛倒入装有高锰酸钾的容器后赶紧撤离实验室，关好门窗。

1.3.2 菌落数量与统计

本次试验设3次重复，相同面积的组培室为单位，面积18m2，采用自然沉降法检测菌落数量，每个组培室采用5个点，分别是组培室4个角落(离墙1.5m)和中间，离地面1.5m高度，将准备好的培养皿在同一高度打开盖放60min后再进行采样，熏蒸前采样和熏蒸6d后采样的培养皿盖上盖后放在恒温箱工作温度为35℃，培养时间为3d，然后按真菌、细菌进行菌落数量统计和分类。

1.3.3 统计方法

根据奥氏公式计算组培室空气的含菌数(cfu·m-3)，再计算出杀菌率，分析各方法的灭菌效果。

空气菌落总数(cfu·m-3)=50000N/A×T

式中，A为培养皿大小，cm2；T为环境中培养的时间，min；N为平均培养皿的菌落数量(cfu/皿)。

杀菌率=(消毒前组培室平均菌落数-消毒后组培室平均菌落数)/消毒前组培室平均菌落数×100%

2 结果与分析

2.1 次氯酸钠的熏蒸效果

从表1可以看出，用次氯酸钠熏蒸后，组培环境熏蒸前后真菌、细菌含量明显减少，真菌的灭菌率达72.83%，细菌的灭菌率达76.59%。组培室平均灭菌率达到73.75%，而且次氯酸钠对细菌的灭杀效果要优于真菌。

2.2 二氧化氯的熏蒸效果

从表2可以看出，使用二氧化氯熏蒸后，对组培环境起到明显的杀菌效果，熏蒸前后细菌、真菌含量明显减少。真菌的灭菌率达85.71%，细菌的灭菌率达81.06%，平均灭菌达到83.93%，并且对真菌灭杀效果优于细菌。

表1 次氯酸钠在组培室的熏蒸效果

表2 二氧化氯在组培室的熏蒸效果

2.3 甲醛的熏蒸效果

从表3可以看出，使用甲醛熏蒸后，对组培环境具有明显杀菌效果，熏蒸前后真菌、细菌数量明显减少。真菌灭菌率达78.11%，细菌的灭菌率达73.84%，平均灭菌达到76.92%，并且甲醛对真菌的灭杀效果要优于细菌，但对细菌的灭菌稍微低。

表3 甲醛在组培室的熏蒸效果

3种熏蒸消毒方法都对组培室环境中真菌、细菌起到很好的杀菌效果。其中，二氧化氯消毒杀菌效果最好，其次是甲醛，次氯酸钠较差。从真菌和细菌的灭菌效果来看，二氧化氯对真菌的杀菌效果优于细菌，甲醛对真菌的效果优于细菌，次氯酸钠对细菌的效果优于真菌。

3 结论

总体来说，二氧化氯、甲醛、次氯酸钠3种环境消毒方法都对环境起到明显的杀菌效果，对环境中的细菌、真菌都能达到灭菌的效果。从灭菌效果、工作人员健康影响、进入实验室时间、成本各方面考虑，二氧化氯最适合于组培室环境消毒。

针对高海拔地区组培实验室的污染源进行消毒是植物组织培养的重要环节[5]，高效安全、低毒无害、环境友好是组培实验室消毒的本质要求和发展趋势。马铃薯组培室的空气清洁度是减少组培污染的重要条件，用于组培室消毒的常规消毒试剂次氯酸钠，不仅味道刺鼻而且对人体有毒害作用,这些气体强烈刺激眼角膜、上呼吸道粘膜等，可引起喉痉孪、喉水肿、支气管炎和急性脑炎等；甲醛熏蒸法会对人体造成一定的危害，长期在组培室工作可能会产生致癌等问题；而使用二氧化氯消毒剂，没有刺鼻的气味，不伤皮肤，经北京市疾控中心检测为实际无毒级产品，优良的杀菌效果及可靠的安全性能，是食用菌生产用消毒剂首选，使用简便，价格低廉，效果显著，既能达到消毒效果，又不会造成人体危害。通过本次试验数据证明，二氧化氯的消毒效果显著且消毒后18h后可以进组培室，实现高海拔组培室消毒剂高效安全、低毒无害、环境友好是组培消毒的本质要求和发展趋势，综合考虑二氧化氯适合用于高海拔地区组培室的消毒，通过二氧化氯消毒剂可减少组培室组培苗的污染，提高组培苗的质量，从根本上解决了马铃薯病虫害造成的减产。而甲醛气味存留时间长，一般消毒后7d左右才能进组培室且对人体会造成一定危害，成本也高；次氯酸钠熏蒸后3d后可以进组培室，消毒结束后应将消毒废液及时倒掉，防止有害气体挥发。消毒操作时须戴好口罩，不宜用手揉眼摸脸等动作，以免对眼睛或皮肤造成伤害。组培室实验的消毒要进行全方位考虑，包括消毒效果、消毒时间、对人体的伤害、成本等方面，以达到最想要的效果。