核桃青皮中多酚类物质的分离纯化及其抗氧化性

李晓华

新疆石河子职业技术学院（石河子 832000）

核桃青皮，也称青龙衣，是包裹在核桃外部的一层绿色果皮，是核桃的主要副产品之一，作为中药材、保健品成分、食品添加剂使用[1]。核桃青皮含有钾、钙、镁、铁等多种矿质元素，并呈现高钾低钠的特点，含有多种挥发油和脂肪酸，具有防止血管硬化、预防高血压和冠心病、抵御衰老和血管结石等保健功效，医学上将其应用于抗肿瘤、抗菌的临床应用[2-3]。由于核桃青皮的医疗保健功效优异，市场上处于供不应求的状态，如何更加有效地提取核桃青皮中有用成分尚有待研究。

试验旨在提取纯度较高的青皮多酚类物质，通过大孔树脂与分离纯化方式的有效结合达到试验目的，并在此基础上研究分析青皮多酚的抗氧化性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

青皮核桃（阿克苏温宿县）；大孔树脂（杭州鑫膜实业有限公司）；无水乙醇（成都化夏化学试剂有限公司）；甲苯（苏州诚享化学材料有限公司）；碳酸氢钠（济南坤丰化工有限公司）。

BSD-YX3600型立式摇床培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；LC210型高效液相色谱仪（上海仪电分析仪器有限公司）；PGZ-978型离心机（苏州优格曼机械有限公司）；UV-2204型紫外可见分光光度计（上海析谱仪器有限公司）。

1.2 大孔树脂的粗提取[4-5]

将极性大孔树脂用无水乙醇浸泡至充分溶胀，用蒸馏水洗涤溶胀大孔树脂至没有乙醇气味时停止。

称取一定量干燥核桃青皮，反复几次研碎、烘干操作，以过0.150 mm筛青皮干燥粉末为标准。向青皮粉末中倒入足量甲苯，塞紧塞子后置于摇床培养箱中，设置环境温度35 ℃，频率30次/min。12 h后取出，少量多次淋洗大孔树脂缓慢吸附，至大孔树脂滴落尾液呈淡绿色或无色时停止，用高效液相色谱仪测定吸附提取液中多酚类物质的含量。

1.3 青皮多酚的纯化[6]

大孔树脂吸附的成分中除了多酚以外，还有大量的色素和脂肪酸，为进一步提高提取纯度，需对洗脱液进行再次纯化。将吸附饱和的大孔树脂湿法装入层析柱中，无水乙醇作为洗脱液以1.0 mL/min的洗脱流速进行洗脱。洗脱液收集于锥形瓶中，缓慢滴加5%NaHCO3溶液（质量分数）至溶液约pH 6.50，离心分离沉淀物，取上清液备用。将上清液置于-20 ℃的恒温冰箱中3 d，取出后迅速分离结晶物与上清液，重复3次冷冻分离结晶物操作后的清液即为纯度较高的青皮多酚溶液。

1.4 抗氧化能力测定方法

1.4.1 抗氧化性

采用硫氰酸铁比色法进行测定[7]。取500 mg吐温-20和青皮多酚样品加磷酸钾缓冲液定容至100 mL制备青皮多酚乳浊液，以青皮多酚标准品与磷酸钾缓冲液配制的混合液为空白对照。在一定温度下避光培养7 d后采用硫氰酸盐法测定其氧化程度，于波长520 nm处测其吸光度。

1.4.2 还原性

采用铁氰酸钾还原法测定青皮多酚的还原能力。在1.0 mL样品溶液中滴入磷酸盐缓冲液和铁氰化钾溶液，在70 ℃水浴条件下加热30 min，加入少量的三氯乙酸溶液后静置至室温，补加去离子水和氯化铁溶液，静置一段时间后于710 nm波长处测吸光度。设置空白管为对照并调零，测定的吸光度越大则青皮多酚还原能力越强。

1.5 试验中的其他分析测试

1.5.1 高效液相色谱分析

流动相选用无水乙醇-水体系，流动相比例3∶1。设置进样量10 μL，流速0.5 mL/min，分离时间45 min，检测波长356 nm，AUFs=0.02，柱温30 ℃，色谱柱型号采用安捷伦Eclipse Plus C18（6.5 mm×300 mm）。

1.5.2 紫外可见分光光度计测定吸光度

取青皮多酚标准品，梯度配制成不同浓度的青皮多酚标准溶液，依次测定其吸光度后，绘制浓度-吸光度拟合曲线，拟合度需大于99%。对试验提取的不同浓度青皮多酚纯化液进行吸光度测定，并与拟合曲线比对，确定测定的准确度，准确度精度±5%。

2 结果与讨论

2.1 青皮多酚的液相色谱分析

图1为试验中大孔树脂吸附的青皮多酚液相色谱图，图2为分离结晶物后的青皮多酚液相色谱图。可以看出，图1中的物质组成成分复杂，有效的青皮多酚含量占比不超过50%，不具备过多的应用价值，应进行合适的纯化处理提高青皮多酚的含量。图2则可以很明显发现出峰的保留时间集中在20～30 min，此区间内的物质含量总和超过80%，且与青皮多酚纯品的保留时间基本一致，判定此区间内的物质成分为青皮多酚类物质（绿原酸、阿魏酸、芥子酸、儿茶素、杨梅酮、胡桃醌等），同时说明分离纯化的试验效果颇佳，达到纯化要求。

图1 大孔树脂吸附的粗提取青皮多酚液相色谱图

图2 青皮多酚分离纯化后的液相色谱图

2.2 淋洗流速对大孔树脂吸附性能的影响

不同淋洗流速条件下大孔树脂吸附量的变化曲线如图3所示。从总体趋势上可以看出，淋洗流速小于3.0 mL/min时，大孔树脂的最终吸附量比较可观，吸附性能良好，基本符合试验实际要求且工作效率较高。足够的吸附量能够提升分离纯化的试验效果，对于后续试验结果分析有益。考虑到试验总时长和分离的多酚含量，确定淋洗流速以2.0 mL/min为宜。

图3 淋洗流速与大孔树脂吸附量的关系曲线

2.3 pH对纯化过程中离心沉淀物的影响

青皮多酚中的糖类物质在弱酸性条件下易与脂肪酸结合后沉降，生成酸性沉降物。青皮多酚为多元酚结构，在弱酸性条件下能保持完好的分子状态，而碱性条件下会促进盐结构的形成，破坏青皮多酚的活性。因而选择弱酸性的条件有利于青皮多酚的纯化。图4为pH与离心沉淀物质量的关系曲线，过酸或过碱的环境下均能产生较多的沉淀物，青皮多酚在酸性较强的环境下结构不稳定，可能会与其他碱性有机物相结合，在碱性条件下则会生成盐结晶。综合考虑试验情况，确定纯化时的pH 6.50。

图4 pH与沉淀物质量的关系曲线

2.4 青皮多酚的抗氧化性分析

2.4.1 抗氧化性和还原性

青皮多酚在一定条件下氧化可产生有机氧化物，这些氧化物能够将Fe2+氧化成Fe3+。通过测定Fe3+与SCN—形成络合物的吸光度可表征青皮多酚的自氧化能力，如图5所示。

图5 青皮多酚的抗氧化性测试曲线

随着时间延长，吸光度增大。这表示随着时间延长，青皮多酚的自氧化物浓度增大，氧化程度加重，所以一般情况下青皮多酚溶液应在低温下贮存以防止其氧化而失去生物活性。

以吸光度评价还原性是表征有机物抗氧化能力的其中一项指标[9]。图6为青皮多酚对Fe3+还原能力的关系曲线。可以看出，还原Fe3+的能力与青皮多酚浓度呈正相关，符合理论实际的同时，说明青皮多酚的抗氧化能力有限，易受到氧化物的影响。

图6 青皮多酚的还原性测试曲线

2.4.2 青皮多酚的质量浓度-吸光度曲线

试验纯化的青皮多酚经紫外可见分光光度计检测在625 nm波长处有最大吸收峰。根据稀释后不同质量浓度青皮多酚所测定的吸光度A，可绘制出质量浓度-吸光度拟合曲线。如图7所示，在一定的浓度范围内，浓度与吸光度之间呈线性关系，即青皮多酚质量浓度的增大对应相应吸光度亦会增大，青皮多酚的质量浓度与其吸光度呈正比，又因质量浓度与其抗氧化性呈正比，进而推出青皮多酚的抗氧化性与吸光度呈正比。

图7 青皮多酚的质量浓度-吸光度拟合曲线

3 结论

以青皮核桃为原料，对粗碎烘干的核桃青皮溶解液采用大孔树脂初次提取，洗脱大孔树脂吸附液后，离心分离沉淀物和多次低温结晶纯化所得青皮多酚类物质上清液。对影响初提取的淋洗流速因素和影响纯化过程的pH因素进行探讨分析，结果发现低淋洗流速有助于获得足够的青皮多酚提取液，确定淋洗流速2.0 mL/min适宜，而pH的过酸或过碱环境下产生较多的沉淀物会影响实际提取到的青皮多酚含量，经过综合考虑确定pH 6.50。用高效液相色谱测定提取液中的青皮多酚含量，将粗提取液与纯化液对比之后发现，试验的纯化过程比较有效，能够将青皮多酚类物质纯度提升至80%以上。试验还对青皮多酚的抗氧化性在抗氧化和还原性2个方面进行探讨，结果发现青皮多酚的自氧化物会随着时间延长而增多，体现为所测得的吸光度增大。同时，还原性测定显示青皮多酚的抗氧化能力有限，正常情况下需低温条件下贮存以防止自氧化。试验分离纯化青皮多酚的试验过程效果良好，并能在一定程度上论证青皮多酚的弱抗氧化能力。