胰激肽原酶对精子质量影响的初步研究*

段 礼，陈 勇，卢奋坚，肖新民，王 胜，田二坡，钟 影，温子娜△

1.四川省成都西囡妇科医院男科中心，四川成都 610011;2.四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心男科中心，四川成都 610011

近年，辅助生殖技术治疗不育不孕症有了长足的进步，其中精子质量是关键因素之一。关于如何保护和提高精子的活力和功能以及如何克服冷冻对精子的不良影响的研究引人关注。目前胰激肽原酶(PK)被广泛应用于男科疾病的治疗，有研究报道其对精液液化及精子质量具有改善作用[1-3]。本研究初步探讨PK对精子质量的影响，为改进精子体外保存条件提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年6-9月来成都西囡妇科医院行辅助生殖治疗体检的男性患者20例，年龄25～35岁。入选标准：精液常规检查各项参数正常，无传染病及遗传病史，近期无吸毒、吸烟、酗酒等不良生活习惯，近期无生殖道感染病史。专科查体：排除精索静脉曲张，排除前列腺肿大。本研究通过成都西囡妇科医院伦理委员会及生殖样本库批准，所有提供精液标本的患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1精液检查 患者禁欲2～7 d，手淫取精置清洁的一次性取精杯内，放入37 ℃恒温箱内孵育。精液液化后，将同一份精液均等地分成3份，编为A、B、C组，严格按照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)[4]的技术规范进行操作。采用重力分析法测量精液体积，采用HAMILTON THORNE IVOS Ⅱ全自动精液分析仪检测精子活力。精液参数正常值参考《WHO人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)标准。采用BD FACSCalibur流式细胞仪检测精子染色质(DNA)的完整性，精子核完整性染色试剂盒采用浙江星博生物科技股份有限公司产品。

1.2.2精子冷冻及复苏 将冷冻保护剂SAGE Quinn′s AdvantageTMSperm Freezing Medium提前置于室温中复温并混匀。A、B、C组均按1份体积冷冻保护剂加入1份体积精液的比例添加保护剂，B、C组中分别再加入40、80 U注射用PK(常州千红生化制药股份有限公司)，逐滴加入并旋转冻存管，将混合液在30～35 ℃孵育5 min，检测3组标本冷冻前的精子常规参数及DNA碎片指数(DFI)。将上述混合液吸入冷冻保存管，再逐步移入液氮中。所有标本冷冻30 d后放入37 ℃的HH-S2恒温水浴锅中复苏，然后利用精液分析仪及流式细胞仪分别检测复苏后的精子常规参数及DFI。

2 结 果

冷冻前A、B、C 3组的前向运动精子百分比呈递增趋势，B、C组与A组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，复苏后3组的前向运动精子百分比呈逐渐上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻前A、B、C 3组的精子活动率呈递增趋势，B、C组与A组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；复苏后B、C组的精子活动率高于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻前A、B、C 3组的精子DFI呈逐渐下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，复苏后A组的DFI高于B、C组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 冷冻前后各组标本的精子参数比较

3 讨 论

目前，随着辅助生殖技术的发展，人类配子、睾丸组织、卵巢组织等冷冻技术也不断提高。精子冷冻技术为供精助孕、男性不育症治疗提供了条件，但其本身也会对精子质量及功能造成不良影响[5-6]。随着冷冻过程中温度的急剧变化，精子细胞内外的冰晶形成，水分子跨膜移动和渗透压变化，很容易引起精子细胞膜和线粒体的变化，导致细胞死亡或细胞核的损伤[7]，体现在复苏后的精子质膜破裂、DNA损伤等方面，最终导致复苏后精子活力下降，存活率降低，受精能力变差。部分研究表明随着冷冻时间的延长，这种影响会不断加大[8]。

影响人类精子冷冻后质量的主要因素有冷冻方法、冷冻保护剂的成分及冻存时间等。近年来，精子的体外冷冻保存技术层出不穷，各种新型冷冻保护剂的问世、冷冻技术的改进，使成功冷冻精子变得更加容易，而怎样减少冷冻对精子的损伤、尽可能保护精子的功能，是目前精子冷冻技术研究的新方向。郑九嘉等[9]研究显示，在精子冷冻保护剂中添加适当浓度的维生素E可以缓解冻融过程对精子造成的伤害，在一定程度上提高冻融后精子的活动力、存活率及精子DNA完整性。本研究在精子冷冻保护剂中添加PK，结果显示冷冻精子复苏后的前向运动精子百分比、精子活动率均有增高趋势，而DFI呈下降趋势，表明PK可能具有一定的保护精子作用。

生殖系统微循环障碍影响精子质量，而改善微循环已经被作为男性不育的基础性治疗方法写入中华医学会男科学分会制订的《中国男科疾病诊断与治疗指南(2016版)》[10-11]。PK又称胰激肽释放酶、血管舒缓素，属蛋白水解酶类，有扩张血管、改善微循环、调整血压等作用[1,11-12]。从20世纪80年代开始，PK就被应用于男性不育的治疗，尽管临床观察结果存在一定的争议，但一些研究结果表明，PK治疗可以改善精子质量[1]。文献[13]报道，体外实验中将PK加入到精液中，可以增强精子的活动力和穿透宫颈黏液的能力，以及提高精子运动速度，而且对冷冻复苏后的精子存活率和运动能力都有积极的作用，这与本研究得出的结果一致。50%以上的患者在接受3个月的PK治疗后，其精子活力得到改善，同时其正常形态精子的百分率也相应提高，因此在人工授精前常可采用PK对精液进行预处理[13]，该结论在本研究中也得到证实，本研究向新鲜精液加入PK恒温孵育5 min后，前向运动精子百分比和精子活动率都有明显提高。

随着辅助生殖技术的发展，获得优良精子是提高成功率的关键，精子的冷冻保存更是治疗男性不育症中必备的技术，特别是微量精子的冷冻成功，为严重少精子、睾丸显微取精获得精子提供了生育亲生后代的可能。本研究证实了PK有助于提高精子体外保存时的活力，不足之处在于，由于要进行冷冻保存，恒温孵育时间仅为5 min，接下来笔者团队将延长孵育时间来进一步验证这一结论。另外，在常规冷冻保护剂中添加PK，冷冻复苏后的精子质量有一定改善，但差异不显著，这一结论有待扩大样本量来进一步验证。