β-catenin调控LL-37促进铜绿假单胞菌的清除*

傅 强,王伟佳,黄福达,缪丽韶，杨山虹，陈 康

广东省中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528403

铜绿假单胞菌为革兰阴性杆菌，是引起院内感染的常见条件致病菌，可引起多种组织器官的感染，如肺部、皮肤、角膜等[1-2]。临床上抗菌药物的使用可以改善患者的病情，然而，随着抗菌药物的不合理使用，导致铜绿假单胞菌的耐药性越发严重，致使应用抗菌药物后不能达到满意的治疗效果[1-2]。因此，如何发挥宿主的能动性、提高免疫防御功能是抗感染免疫的研究热点。

Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路是进化高度保守的通路，尽管参与该通路的分子众多，β-catenin是该通路中的核心分子。当Wnt/β-catenin通路未被激活时， β-catenin被降解失活。当Wnt/β-catenin通路被激活后，β-catenin在细胞质中累积并转移至细胞核促进下游靶基因的转录，参与胚胎的发育和多器官的稳态[1,3-4]。有报道显示，β-catenin可参与病原体的感染过程，且因病原体的种类不同，发挥不同的作用。有研究报道，β-catenin抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制，抑制DNA病毒的感染，抑制伤寒沙门菌的感染[5-7]；另一方面，β-catenin促进Ⅰ型牛疱疹病毒的感染[8]。然而，β-catenin在铜绿假单胞菌感染中的作用还需研究。抗菌肽LL-37是具有广谱抗菌作用的多肽，可促进铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等病原体的清除[9-11]。在结肠癌中，β-catenin和LL-37相伴增高[12]。然而β-catenin是否通过调控LL-37来促进铜绿假单胞菌的清除还需进一步研究。

本研究发现，在RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞中，β-catenin促进铜绿假单胞菌的清除；同时实验发现，β-catenin促进LL-37的基因表达；进一步实验发现LL-37可回复β-catenin介导的细菌清除作用，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞培养 小鼠成纤维细胞株L929和小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞在含10%胎牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)条件下培养。L929细胞培养7 d后，收集细胞培养上清液，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min去除细胞碎片，经0.22 μm滤器过滤后分装，-80 ℃保存备用。L929细胞上清液中富含集落刺激分子，可诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。过表达β-catenin的RAW264.7细胞和对照细胞以1×106个/毫升细胞数铺入6孔板中，培养过夜，铜绿假单胞菌感染后进行后续细菌平板计数和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)。

1.2小鼠骨髓来源巨噬细胞分离培养 无特定病原体(SPF)级6周龄雌性C57BL/6小鼠，处死后无菌条件下取股骨和胫骨中的骨髓细胞，制备单细胞悬液，1×107铺入10 cm培养皿中，置于含5%胎牛血清、10% L929培养上清液的高糖DMEM中培养7 d，诱导成骨髓来源巨噬细胞。用β-catenin慢病毒和对照慢病毒感染骨髓来源巨噬细胞，过表达β-catenin[13]。然后，以5×105个/毫升细胞数铺入6孔板中，培养过夜，铜绿假单胞菌感染后进行后续细菌平板计数和Real-time PCR。

1.3小RNA干扰实验 小鼠LL-37的小干扰RNA(siRNA)和小干扰RNA对照(siNC)购于Santa Cruz Biotechnology公司。按照说明书采用阳离子脂质体2000转染，以5 μmol/L为siRNA的终水平沉默细胞中LL-37，进行后续的细菌清除实验。

表1 引物序列

1.5细菌清除实验 RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞加入铜绿假单胞菌共孵育1 h后，更换含300 μg/mL 庆大霉素的培养基作用30 min清除胞外菌，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，设置两个复孔，一个复孔收集1 h细胞悬液，0.1% 曲拉通-X裂解细胞释放细胞内细菌，平板计数计算1 h菌落数；另一个复孔继续培养1 h，收集2 h细胞悬液，0.1% 曲拉通-X裂解细胞释放细胞内细菌，平板计数计算2 h菌落数。细菌清除率=(1 h菌落数-2 h菌落数)/1 h菌落数×100%。

2 结 果

2.1β-catenin促进铜绿假单胞菌的清除 铜绿假单胞菌感染过表达β-catenin的RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞后，细菌平板计数检测细菌清除情况。实验结果发现，在RAW264.7细胞(图 1A)和骨髓来源巨噬细胞(图 1B)中，β-catenin促进细菌的清除，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2铜绿假单胞菌感染时，β-catenin促进LL-37基因的表达 实验结果发现，在RAW264.7细胞中细菌感染12 h后，β-catenin促进抗菌肽LL-37的表达(图 2A)；同样发现，在骨髓来源巨噬细胞细菌感染12 h后，β-catenin促进抗菌肽LL-37的表达(图2B)。

2.3β-catenin调控LL-37促进铜绿假单胞菌的清除 在过表达β-catenin的RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞中，铜绿假单胞菌感染后，采用平板计数的方法检测细菌清除率。实验结果发现，过表达β-catenin可在RAW264.7细胞(图3A)和骨髓来源巨噬细胞(图3B)中促进细菌清除；实验结果进一步显示，LL-37可在RAW264.7细胞(图3A)和骨髓来源巨噬细胞(图3B)中回复β-catenin的杀菌作用。

注：*P<0.05，**P<0.01;A为RAW264.7细胞；B为骨髓来源巨噬细胞。

注：*P<0.05，**P<0.01;0 h和12 h分别表示铜绿假单胞菌未感染及感染后12 h;A为RAW264.7细胞；B为骨髓来源巨噬细胞。

注：*P<0.05，**P<0.01；A为RAW264.7细胞；B为骨髓来源巨噬细胞。

3 讨 论

β-catenin是进化高度保守的Wnt/β-catenin通路中的核心分子，不仅在生理状态下发挥重要作用[3-4]，还可在病理条件下如多种病原体感染中发挥调控作用，且因病原体不同发挥的作用不尽相同[5-8]。本研究发现，在铜绿假单胞菌感染时，β-catenin促进铜绿假单胞菌的清除。

β-catenin促进铜绿假单胞菌清除的机制如何，还有待于进一步研究。研究报道，在不同病原体感染中β-catenin促进病原体清除的机制不尽相同。据报道，在伤寒沙门菌感染时，β-catenin可通过上调小肠上皮细胞的核心岩藻糖基化而上调肠道菌群来对抗细菌感染[7]；在HIV感染时，β-catenin可在胶质细胞中抑制HIV长末端重复序列的转录，抑制病毒的感染[5]；在DNA病毒感染时，β-catenin可协调环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cGAS)/干扰素基因刺激因子(STING)介导的干扰素信号通路，抑制感染[6]；在猪生殖和呼吸系统综合征病毒感染时，β-catenin可通过增强核因子活化B细胞κ轻链增强子(NF-κB)介导的自身免疫应答抑制病毒的复制[14]。本实验结果发现β-catenin可上调抗菌肽LL-37的表达。

LL-37是具有广谱杀菌作用的抗菌肽。研究报道，LL-37可抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，可促进中性粒细胞释放活性氧自由基，促进中性粒细胞体外诱捕网的形成，从而达到促进铜绿假单胞菌清除的作用[10-11]。本实验结果发现，在铜绿假单胞菌感染的巨噬细胞中，β-catenin通过调控LL-37促进铜绿假单胞菌的清除，然而本研究未涉及LL-37促进细菌清除的机制。

综上所述，本研究发现β-catenin在巨噬细胞中通过调控LL-37促进铜绿假单胞菌的清除，揭示了β-catenin促进铜绿假单胞菌清除的机制，为铜绿假单胞菌感染的治疗提供备选方案。