同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法检测血浆18-羟皮质酮方法的建立及初步临床应用

尹逸丛，禹松林，于佳磊，王丹晨，马超超,2，邹雨桐,2，谢少伟，程 倩，邱 玲

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科 疑难重症及罕见病国家重点实验室，北京 100730 2中国医学科学院 北京协和医学院研究生院，北京 100005

原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism, PA)是一种以高血压、高醛固酮、低血钾及低肾素为主要特征的临床综合征。与同等程度的原发性高血压相比，PA与心血管疾病、肾脏疾病的患病率及死亡率增加关系更为密切[1- 3]。PA的诊断和分型一直是临床难点，目前常采用的定性诊断方法肾上腺CT对PA主要亚型(醛固酮瘤与特发性醛固酮增多症)难以作出鉴别诊断，易误诊[3- 5]。双侧肾上腺静脉取血对PA的诊断以及分型具有较高的灵敏度和特异度，但其为有创检查且费用高昂，无法作为筛查手段广泛应用。

18-羟皮质酮(18-Hydroxycorticosterone, 18-OHB)是醛固酮生物合成过程中生成的前体物质，在醛固酮合酶(少部分由11β-羟化酶催化)的催化下由皮质酮转化而来，正常人群血浆含量极低[6- 7]。PA患者血清钠离子浓度降低及血管紧张素Ⅱ水平升高可促进醛固酮的合成，血浆18-OHB水平亦随之升高[8]。既往文献报道，18-OHB在醛固酮瘤与特发性醛固酮增多症的鉴别诊断中发挥重要作用[9- 11]，且醛固酮瘤患者仰卧位时的血浆18-OHB水平与正常受试者或特发性醛固酮增多症患者的18-OHB水平无重叠，可用于PA的诊断以及分型鉴别。目前，18-OHB的检测方法主要为放射免疫分析法[9]和酶联免疫吸附法[12- 13]，但存在免疫学交叉干扰及放射性污染等局限性。超高效液相色谱串联质谱法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)基于对离子对的检测，特异度高，且可避免交叉反应的干扰，准确性亦较高。本研究试图建立一种同位素稀释UPLC-MS/MS(isotope dilution UPLC-MS/MS, ID-UPLC-MS/MS)检测血浆18-OHB的方法，并初步用于临床样本检测。

1 材料与方法

1.1 一般材料

回顾性收集2018年9月至12月北京协和医院检验科临床检测剩余血浆制备的混合血浆标本，用于该方法性能评价。

本研究已通过北京协和医院伦理审查委员会审批(伦理号：HS- 1783)。

1.2 性能评价方法

1.2.1 仪器与试剂

主要仪器LC-MS/MS系统包括Waters Acquity UPLC色谱仪系统(美国Waters公司)和Waters XEVQ TQ-S串联四极杆质谱仪(美国Waters公司)，其他仪器包括96孔正压提取装置(美国Waters公司)。主要试剂包括18-OHB标准品(浓度100 mg/L)购自美国Sigma公司，同位素氚标记的内标18-OHB(18-OHB-d4，浓度100 mg/L)购自美国Iso Science公司，色谱级甲醇、乙腈及正己烷购自美国Fisher Scientific公司，甲酸购自美国Sigma公司,氟化铵购自国药集团化学试剂有限公司,无激素血浆购自美国Seracare公司。

1.2.2 分析条件

(1)色谱分析条件：色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，粒径1.7 μm)，以纯水为流动相A，乙腈为流动相B。采用梯度洗脱：0～2.5 min 75% A相，2.5～3.0 min 65% B相，3.0～4.0 min 5% A相，4.0 min 75% A相，流速0.4 mL/min。柱温为50 ℃，进样10 μL。(2)质谱分析条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式(multiple reaction monitor，MRM)。18-OHB的MRM检测离子对为m/z 363.16>269.075(定量用)，363.16>146.99(定性用)；18-OHB-d4的MRM检测离子对为367.16>273.026。去溶剂气压为1100 psi，碰撞气为8 psi，喷雾电压为-4500 V，去溶剂温度为550 ℃。

1.2.3 样本前处理

1.2.3.1 标准溶液和内标溶液的配制

(1)标准溶液：取10 μL 18-OHB标准品原液(浓度100 mg/L)与990 μL 甲醇溶液，混匀后得到浓度为1 mg/L的18-OHB标准溶液，取100 μL浓度为1 mg/L的18-OHB标准品与900 μL 甲醇溶液混合后得到浓度为100 μg/L的18-OHB标准溶液。之后用无激素血浆将浓度为100 μg/L的18-OHB标准溶液按比例稀释至浓度为10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 μg/L的标准溶液。(2)先取10 μL 18-OHB-d4溶液与990 μL甲醇溶液混匀后得到浓度为1 mg/L的18-OHB-d4溶液，取100 μL浓度为1 mg/L的18-OHB-d4溶液与900 μL甲醇溶液混合后得到浓度为100 μg/L的18-OHB-d4溶液，之后取200 μL浓度为100 μg/L的18-OHB-d4溶液与800 μL甲醇溶液混匀，准确配制浓度为20 μg/L的储备内标溶液。使用时用50%甲醇水溶液将储备内标溶液稀释为2 μg/L的工作液。标准溶液和内标溶液均分装于1 mL安瓿瓶中，-80 ℃保存备用。

1.2.3.2 样本去蛋白

取血浆标本或标准溶液200 μL，分别置于1.5 mL离心管中，加入内标工作液20 μL、甲醇300 μL，以沉淀蛋白；将混合液振荡混匀，加入400 μL纯水稀释，振荡混匀，13 000g离心10 min收集上清液。

1.2.3.3 样本萃取

采用Waters Oasis Prime HLB Elution 96孔SPE板对去蛋白后的样本进行抽提和萃取。每孔预先加入甲醇和纯水各200 μL进行活化。取750 μL去蛋白后的上清液至SPE板孔位，用正压力氮吹仪吹下并丢弃废液。之后依次加入10%乙腈水、正己烷各200 μL，以洗脱亲水、亲有机相以及不同极性的杂质。每个样品孔加入70%甲醇水溶液50 μL进行洗脱。收集洗脱液，加入40 μL纯水，混匀，2485g离心10 min后上机检测。

1.3 性能评价指标

1.3.1 精密度评价

血浆标本共分装3份，分别加入不同浓度的18-OHB标准品制备低、中、高3个水平(浓度分别为0.2、0.5、2.0 μg/L)的待测样本，每批次各浓度样本均检测5份，重复5个工作批次(约30 d完成)。计算该方法的重复性及实验室内不精密度，重复性以变异系数(coefficient of variation, CV)表示，CV<15%可接受。

1.3.2 加标回收率试验

取180 μL混合血浆，分别添加20 μL不同浓度的18-OHB标准品，制备18-OHB浓度为0.2、0.5及2 μg/L的待测样本，每个浓度水平平行处理5份样本，检测后取均值，并与理论值进行比较，计算加标回收率=实测值/理论值×100%。加标回收率在80%～120%为可接受。

1.3.3 定量检测下限

取浓度为1 μg/L的18-OHB标准品，用无激素血浆分别稀释至0.005、0.01、0.02 μg/L，每个浓度重复检测20次，定量下限应满足CV≤20%(重复检测20次的CV)信噪比(S/N)≥10且百分偏倚≤10%。

1.3.4 线性评估

取浓度为100 μg/L的18-OHB标准品，用无激素血浆按比例分别稀释为10、5、2、1、0.5、0.2及0.1 μg/L，参照上述步骤进行样本前处理后按浓度由低至高依次测定18-OHB浓度。以标准溶液浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴进行线性回归分析，经“1/X”加权得到回归方程。将样品峰面积比代入标准曲线方程，计算各浓度点18-OHB水平，重复测定2次取均值为最终结果，并计算各浓度的检测偏倚，百分偏倚≤10%为可接受。

1.3.5 基质效应评估

取7份混合血浆样本，经样本前处理、上机检测获取其样本峰面积与内标峰面积之比(P0)。分别向样本中加入0.5、2、10 μg/L的18-OHB标准品10 μL，再次上机检测获取样本峰面积与内标峰面积之比(分别为P1、P2和P3)。取未经样本前处理、溶于40%甲醇水溶液、浓度分别为0.5、2、10 μg/L的18-OHB标准品，经上机检测获得其样本与内标峰面积之比(P’)，计算基质效应=(Pn-P0)/P’%。基质效应在1±20%内为可接受。

1.4 初步临床应用

1.4.1 健康志愿者招募

2019年11月起于北京协和医院招募表观健康志愿者，采集其空腹静脉血测定18-OHB浓度，用于验证梅奥医学实验中心提供的18-OHB参考范围。

表观健康志愿者纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)汉族(包括其父母)；(3)自觉身体健康，无身体不适；(5)在现居住地居住1年以上。排除标准：(1)处于妊娠期或近1年内有妊娠史的女性；(2)合并心血管疾病(高血压、冠心病、心肌炎、心力衰竭等)、肝肾功能异常、高血脂、肿瘤、中枢神经系统疾病(垂体、下丘脑疾病；内分泌、代谢或神经系统疾病)、自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、狼疮性疾病)；(3)近1个月有可能引起血压波动药物(止痛药、避孕药、感冒药、中药、生长激素、促红细胞生成素、类固醇激素等)或近2周有抗生素服用史；(4)近1个月定期值夜班或近1周作息明显紊乱者；(5)近3个月内献血者；(6)合并病毒性肝炎或自身免疫缺陷疾病；(7)体质量指数>28 kg/m2或<18 kg/m2者。

1.4.2 验证方法

上午7∶00至9∶00，采集表观健康志愿者空腹静脉血标本6 mL(EDTA-K2抗凝)，抽血前保持非卧位至少2 h。离心后分离血浆，应用本研究建立的方法(ID-UPLC-MS/MS)检测18-OHB浓度，并对梅奥医学实验中心提供的18-OHB参考范围进行验证。梅奥医学实验中心提供的18-OHB参考范围：正常成人上午8∶00立位18-OHB参考范围为0.05～0.46 μg/L。10%以上的人群血浆18-OHB检测值超出参考范围上下限即视为验证不通过。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0及Excel 2016软件进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验评估计量资料是否符合正态分布。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示；非正态分布的计量资料以中位数(四分位数)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 色谱分析图

18-OHB标准品(5 μg/L)及内标的保留时间约为1.75 min，分析时间约为3.0 min，分离良好、无干扰，见图1。

2.2 精密度评价

ID-UPLC-MS/MS检测低、中、高3个水平18-OHB的实验室内不精密度为3.7%～5.0%，重复性CV为2.2%～3.5%，均为可接受、满足检测要求，见表1。

2.3 加标回收率

ID-UPLC-MS/MS法检测18-OHB标准品的浓度分别为0.2、0.5及2 μg/L，平均加标回收率分别为98.1%(95.0%～99.2%)、98.4%(96.2%～102.3%)及101.7%(100.1%～104.2%)，提示18-OHB的加标回收率在可接受范围内，检测数据可靠。

2.4 定量检测下限

对浓度为0.005、0.01和0.02 μg/L的标准品，分别重复检测20次，CV分别为35.04%、12.77%和5.24%，0.01和0.02 μg/L标准品的百分偏倚≤10%且S/N≥10，故本研究建立的ID-UPLC-MS/MS法检测18-OHB的定量检测下限为0.01 μg/L。

2.5 线性评估

ID-UPLC-MS/MS法测定的18-OHB在0.02～10 μg/L范围内线性良好(r>0.990)，对不同浓度的18-OHB检测偏倚为-7.4%～3.8%，见图2。

2.6 基质效应评估

7份混合血浆样本的基质效应为86.83%～119.00%，提示血浆基质对低、中、高浓度18-OHB的检测结果无明显影响(图3)。

图 1 18-OHB标准品及血浆样本同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法分析图

图 2 18-羟皮质酮线性评估图

图 3 18-羟皮质酮的基质效应评估

2.7 临床样本中18-羟皮质酮的测定

共纳入73名表观健康志愿者用于验证ID-UPLC-MS/MS,检测临床样本血浆18-OHB浓度。其中男性29名(年龄为22～67岁，中位年龄为42岁)，女性44名(年龄为20～65岁，中位年龄为43.5岁)。经ID-UPLC-MS/MS测定，其血浆18-OHB浓度为0.01～0.68 μg/L，中位数(四分位数)为0.03(0.02，0.10)μg/L，第2.5、97.5百分位数为0.01、0.60 μg/L。男性志愿者血浆18-OHB浓度的中位数(四分位数)为0.14(0.04，0.30)μg/L，女性为0.03(0.02，0.03)μg/L。Mann-WhitneyU检验显示，男性志愿者血浆18-OHB浓度高于女性(P=0.000)。其中，66%(48/73)18-OHB水平处于梅奥医学实验中心提供的参考范围外，提示验证不通过。

表 1 18-OHB精密度评价结果

3 讨论

本研究尝试建立一种血浆18-OHB检测方法，以用于PA的诊断和分型。分别从ID-UPLC-MS/MS检测18-OHB的精密度、加标回收率、定量检测下限、基质效应等方面对该方法的性能进行评估。结果显示，18-OHB及内标的保留时间约为1.75 min，分析时间约为3.0 min；基质效应为86.83%～119.00%，实验室内不精密度为3.7%～5.0%，重复性CV为2.2%～3.5%，平均加标回收率为98.1%～101.7%，定量检测下限为0.01 μg/L，提示ID-UPLC-MS/MS对血浆18-OHB分离良好、无干扰，血浆基质对18-OHB检测结果无明显影响，方法准确、灵敏度高、重复性好，检测数据可靠、可满足检测要求。进一步将其应用于临床样本18-OHB的测定，结果显示基于该方法建立的表观健康人群血浆18-OHB的第2.5分位数和第97.5分位数分别为0.01、0.60 μg/L。

作为一种继发性高血压，PA的临床表现及生化检查与原发性高血压具有一定相似度，常规检查在PA的鉴别诊断中应用受限。同时，PA属于异质性较强的一类疾病，分型不同治疗方式亦存在差异，因此，早期对PA进行诊断，并明确其分型，有助于精准治疗，以改善患者预后、降低并发症发生。18-OHB是肾上腺产生的一种兼具醛固酮、皮质醇结构特征的21-碳类固醇，具有排钾保钠的作用，高血压患者血浆18-OHB表达增高，且不同类型高血压中其升高的程度不同。一项研究比较了62例原发性高血压、20例醛固酮腺瘤和62例特发性醛固酮增多症患者血浆18-OHB表达的差异[14]，结果显示醛固酮腺瘤组和特发性醛固酮增多症组患者血浆18-OHB明显高于原发性高血压组，且醛固酮腺瘤组高于特发性醛固酮增多症组。Phillips等[15]研究显示，在体位试验时18-OHB水平能较好区分醛固酮腺瘤与特发性醛固酮增多症(18-OHB均值：142.1 ng/L比 38.8 ng/L)。

18-OHB的检测方法包括放射免疫法、酶联免疫吸附法及液相色谱串联质谱法(iquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)，但放射免疫法、酶联免疫吸附法因存在免疫反应的非特异交叉干扰及放射性污染等问题而应用受限。LC-MS/MS是将色谱的高效分离能力和质谱的高特异度、高灵敏度相结合的分离分析技术，同时具有样本用量少、高通量、检测速度快的优势，在临床中有更广泛的应用前景。Auchus等[16]应用LC-MS/MS检测PA患者血浆18-OHB浓度，但其使用的内标是氚标记的地塞米松而非同位素标记的同种物质。Makowski等[17]建立了18-OHB的LC-MS/MS检测方法，但该方法的实验室内不精密度较差(12.32%～35.27%)，加标回收率较低(62%～76%)。UPLC-MS/MS在LC-MS/MS基础上进一步提高了检测效率及检测的灵敏度，而ID-UPLC-MS/MS不仅可减小样品前处理造成的误差，且检测的特异度更高，是目前使用最广泛的LC-MS/MS检测方法。本研究以同位素氚标记的18-OHB为内标尝试建立血浆18-OHB的ID-UPLC-MS/MS检测方法。结果显示，18-OHB及内标的保留时间约为1.75 min，分析时间约为3.0 min，提示该方法对18-OHB的分离性良好，分析结果无干扰。且实验室内不精密度≤5.0%，重复性CV≤3.5%，提示其对18-OHB的检测符合临床要求。

进一步从加标回收率、定量检测下限、线性评估、基质效应等方面对该检测方法进行性能评估。加标回收率用于衡量该方法检测待检物质的可行性，其数值在80%～120%认为较合适。线性评估用于反映检测方法对一定范围内待检物质的检测偏倚，其相关系数r>0.99且百分偏倚≤10%为可接受。基质效应用于衡量基质对待检物质的影响，其值在1±20%内可接受。本研究ID-UPLC-MS/MS检测血浆18-OHB的平均加标回收率为98.1%～101.7%，检测偏倚为-7.4%～3.8%，基质效应为86.83%～119.00%，提示血浆基质对18-OHB检测结果无明显影响、检测数据可靠，检测血浆18-OHB具有可行性。梅奥医学实验中心提供的正常成人血浆18-OHB参考范围为0.05～0.46 μg/L，卧位原发性高血压、特发性醛固酮增多症、醛固酮腺瘤患者分别为0.567(0.462，0.695)μg/L，0.654(0.513，0.835)μg/L，1.090(0.792，1.324)μg/L[14]。本研究ID-UPLC-MS/MS测定血浆18-OHB的下限为0.01 μg/L，提示可满足临床需求。

在上述结果的基础上，本研究对招募的73名表观健康志愿者采用ID-UPLC-MS/MS进行血浆18-OHB测定，初步用于临床样本分析。结果显示，ID-UPLC-MS/MS检测的73名表观健康志愿者清晨空腹非卧位血浆18-OHB参考区间为0.01～0.68 μg/L；男性志愿者血浆18-OHB水平高于女性，与既往放射免疫法测定的血浆18-OHB不存在性别差异的结果不相符[18]。可能与纳入的受试者较少或受试者年龄不同有关。经比较，66%(48/73)18-OHB水平处于梅奥医学实验中心提供的参考范围外，可能原因：(1)血浆18-OHB水平受人群摄盐量的影响，本研究招募的志愿者未要求严格控制摄盐量，为普钠状态下采集血液标本。欧美人群与中国人群的饮食习惯、摄盐量差异大，导致本检测结果与梅奥医学实验中心提供的参考范围存在差异。(2)血浆18-OHB水平受体位的影响，梅奥医学实验中心提供的参考范围为立位时的数据，为提高受试者的依从性，本研究要求受试者在非卧位状态(包括坐位和立位)下采血，影响检测结果；(3)血浆18-OHB水平可能存在种族差异，因此本实验室后续考虑建立基于中国人群的18-OHB参考区间。

本研究局限性：(1)缺乏18-OHB测定的稳定性研究，稳定性实验是长期观察性研究，今后应补充相关工作。(2)因未成功验证梅奥医学中心的18-OHB参考范围，因此应扩大人群招募数量，建立本实验室的18-OHB参考区间。(3)因血浆18-OHB可能与摄盐量相关，今后的实验设计应考虑到摄盐量与18-OHB的关系。

综上，本研究成功建立了基于ID-UPLC/MS/MS的血浆18-OHB检测方法，测定结果准确、可靠且快速，适用于临床检测，为PA的诊断及鉴别诊断提供了方法学基础。此外，本实验室已成功建立了基于该平台的醛固酮检测方法[19]。期待未来研究纳入更多病例，以探究血浆18-OHB与其下游代谢产物醛固酮的相关性。

作者贡献：尹逸丛负责实验设计、病例招募、数据采集与整理、统计分析、论文撰写；禹松林参与实验设计、数据整理、论文撰写；于佳磊参与实验设计、实验操作；王丹晨、马超超、邹雨桐负责病例招募、数据采集与整理；谢少伟、程倩负责样本采集、实验操作；邱玲参与实验设计、病例招募、数据采集与整理，负责论文修订与审核。

利益冲突：无