朱智锋,刘萍,许让伟,陈传武,邓崇岭,牛英,朱壹,王鹏蔚,邓秀新,程运江✉
1华中农业大学园艺林学学院/国家柑橘保鲜技术研发专业中心/农业农村部园艺作物生物学与种质创制(果树)重点实验室/园艺植物生物学教育部重点实验室,武汉 430070;2广西柑橘育种与栽培工程技术研究中心/广西特色作物研究院,广西桂林 541004;3江西绿萌科技控股有限公司,江西信丰 341600
【研究意义】沙糖橘(Citrusreticulate)具有皮薄、化渣、汁多、含糖量高、口感清甜的特点,深受消费者的青睐[1];广西桂林是中国最大的沙糖橘产区,2018年种植面积7.70万hm2,产量161.10万t[2]。但是保鲜期短,腐烂损耗大等采后问题已成为制约沙糖橘产业高质量发展的瓶颈;桂林沙糖橘正常成熟期为12月下旬,正值不同类型柑橘集中上市期,销售压力逐年增加,亟需寻找延长沙糖橘错峰销售的实用技术。【前人研究进展】20世纪50年代,日本发明了地膜覆盖技术并应用于农业生产且取得显著成效,我国于1979年引进该技术[3-4],20世纪末在三峡库区开展柑橘地膜覆盖试验,并根据我国柑橘产区的气候特点进行了改良,采用地表覆膜和果实套袋等辅助措施防止冻害,以确保树体和留树保鲜的果实安全越冬,这些措施在三峡库区的大水体周边取得了良好的效果。沙糖橘对积温要求很高,其自然成熟期持续的阴雨和低温冷害成为制约广西沙糖橘稳产增收的突出问题,直接引入三峡库区等地的留树保鲜技术无法从根本上解决桂林沙糖橘越冬问题。在生产实践中,广西特色作物研究院等单位发明了树冠覆膜的留树保鲜技术,近年来在广西等柑橘主产区大范围应用[5-6]。已有的研究表明,柑橘树冠覆膜可增加果皮重量、提高可溶性固形物含量、影响可滴定酸含量从而改变固酸比,显著降低落果率、冻害发生率,有效减少因低温而形成的冻伤疤痕[7-10],树冠覆膜会降低单果重、延缓果皮光泽度的下降、提高颜色指标a*值使果实呈橘红色[7,9,11];但随着覆膜后采收期的延长,果实腐烂率增加、失重速率加快[12]、果实浮皮率上升[13]。【本研究切入点】过去10余年的生产实践表明,桂北沙糖橘树冠覆膜实现了沙糖橘安全越冬的目标,笔者前期调研发现,树冠覆膜对沙糖橘的品质和采后保鲜性能也产生很大影响,但具体的作用机制还缺乏相关研究。前人的研究主要聚焦在树冠覆膜对果实口感品质、外观色泽和产业效益的影响,而对长达2—3个月覆膜后果实的品质和代谢物变化趋势、不同采收期的保鲜性能、科学合理采收时期的确定以及采后保鲜性能改善的原因还缺乏相关研究。【拟解决的关键问题】阐明树冠覆膜改善沙糖橘保鲜性能的机制,从果实品质及保鲜性能综合分析留树保鲜的合理期限,以期确定沙糖橘树冠覆膜的适宜采收期,为沙糖橘产业可持续发展提供理论支撑。
试验于2017年12月22日至2018年3月30日在广西壮族自治区桂林市荔浦县青山镇所底屯果园进行,试验材料为生长一致的7年生沙糖橘,枳砧,平地果园;2017年12月22日采用双行倒“V”型对树冠覆膜,每隔两行覆膜,取中间两行不覆膜的行作为对照,覆膜材料为聚氯乙烯无色薄膜(厚度0.04—0.08 mm,幅宽6—8 m),在树冠顶上30—40 cm处薄膜覆盖并遮住四周。覆膜前一周,选晴天对树体进行杀虫杀菌处理。取样时随机选取对照和树冠覆膜处理各8株,每株在东、西、南、北、中5个方位采果,每个方位随机采取9个果实,每株采45个果实。晴天无雨水天气采样,于12月29日进行第一次取样,此后根据天气状况间隔约15 d采样,共采样7次,试样果实用透气的泡沫盒包装好,当天直接运回实验室。
1.2.1 色差分析 果实色差测定参照朱峰[14]的方法,采用色彩色差仪(C-400 colorimeter,Minolta Corp,Osaka,Japan)。随机选取10个果实测定果皮的L*值、a*值、b*值,每个果实在赤道面测6个点,取平均值。L*值表征亮度,L*值越大亮度越高。a*值由负到正表征果实由绿到红的变化趋势,正值越大,红色越深;负值越小,绿色越深。b*值由负到正表征果实由蓝到黄的变化趋势,正值越大,黄色越深;负值越小,蓝色越深。
1.2.2 可溶性固形物和可滴定酸的测定 随机选取18个果实榨汁混匀。果肉可溶性固形物(total soluble solid,TSS)按照爱宕数显糖度计 PAL-1(Atago,Japan)的使用说明测定。可滴定酸(titratable acid,TA)的测定参照酸度计(GMK-835,G-WON HITECH CO,LTD,Korea)使用说明操作,取上述每组中的果汁0.306 mL加入到30 mL蒸馏水中稀释混匀,上机测定。以上指标均在仪器上重复测定3次。
1.2.3 初生代谢物提取及分析 随机选取 16个果实,将果皮、果肉分离后,分别用液氮冷冻并磨成粉末状,每组样品的果肉取3份,每份称取0.3—0.4 g。样品初生代谢物的提取参照刘淑桢等[15]的方法,样品的衍生化步骤参照盛玲[16]的方法,质谱分析条件参照孙晓华[17]的方法。以核糖醇为内标(0.2 mg·mL-1)加入300 μL,通过内标浓度和最后上机的总体系及峰面积的比值计算每g样品中相应物质的量。测定结果取其平均值,代谢物含量以μg·g-1鲜重(μg·g-1FW)表示。
1.2.4 呼吸速率测定 设2个生物学重复,每8个果实为一生物学重复,每个生物学重复取3次。称重后密封在2.5 L塑料盒中,25℃放置2 h;用1 mL注射器抽取气体顶空注入气相色谱仪(Gas Chromatography,Agilent,7890A,USA)(CTR-1填充柱(Altech),FID检测器)。测完用排水法计算果实的体积。呼吸速率计算公式根据本实验室前期制作的 CO2标准曲线:Y(CO2量)=CO2峰面积/26377,气态CO2的密度为 1.977 mg·mL-1。呼吸速率为:CO2mL·kg-1·h-1。
1.2.5 果实腐烂率和失重率测定 将采收的果实随机各取180个贮藏于室温(10—18℃)、相对湿度(RH)50%—65%的环境条件下,贮藏一段时间统计腐烂数计算腐烂率。每个处理取 20个果实分别编号,每隔15 d对相应编号果实称重计算失重率。
1.2.6 果皮总蜡提取及分析 采样后立即提取果面蜡质,总蜡的提取和果皮表面积的计算参考王金秋[18]的方法,并对GC-MS样品制备稍作修改:取10 mL样品溶液,用氮吹仪吹干,加入100 μL N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid,BSTFA,Sigma),充分振荡混匀后放入70℃烘箱衍生化孵育1 h,结束后放入常温下冷却,再加100 μL色谱纯三氯甲烷。用孔径0.22 μm的针筒微孔滤膜过滤至玻璃内插管中,用于 GC-MS测定。GC-MS测定条件:气相色谱-质谱联用(Thermo,DSQⅡ),TR-1 ms毛细管柱(100%二甲基聚硅氧烷,30 m×25 μm×0.1 μm),EI离子源(70 eV),扫描范围50—650 m/z,进样口温度250℃,离子源温度 300℃,传输线温度 250℃,氢气为载气,流量为1.2 mL·min-1;程序升温:70℃起始,保持1 min,以 10℃·min-1升至 200℃,保持 1 min,2℃·min-1升至270℃,保持1 min,1℃·min-1升至300℃,保持1 min,3℃·min-1升至320℃,保持5 min,分流比10﹕1;自动进样,进样量1 μL。GC测定程序同GC-MS。
1.2.7 RNA提取及定量分析 果皮 RNA提取采用Trizol法,参照刘庆[19]的方法。反转录成单链 cDNA操作按照 HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme)商业操作说明进行。引物经Primer 5和Primer Express软件(Applied Biosystems,CA,USA)设计完成,并在phytozome12网站中克里曼丁数据库将前后引物反向Blaste验证,结果都只比对到1条目的基因,定量引物由上海生工生物工程公司合成。实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)在 Light Cycler®480(Roche Applied Science)仪器的384孔板上完成。体系(10 μL)的配制和程序设置根据试剂盒 Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix(No Rox)的操作说明进行。基因的表达量数据分析采用 2-ΔΔCT计算。
1.2.8 果皮脱落酸含量(ABA)的测定 果皮 ABA测定方法参照朱峰[14]的报道。采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assays,简称ELISA)检测柑橘有色层中ABA含量(试剂盒由中国农业大学王保民教授提供),步骤分为样品内ABA含量提取及ELISA竞争免疫反应测定两部分(因样品原因,只测定了12月29日、1月10日和1月12日3个时期)。
采用Excel 2003进行数据统计,用SPSS 20.0软件中 Duncan新复极差法对数据进行差异显著性和相关性分析,用Origin 8.0和TBtools软件作图。
果面色泽是衡量果实外观品质的重要指标。测定不同采收时期果实的色差指数发现,随着留树保鲜时间的延长,沙糖橘果皮亮度总体呈下降的趋势(图1-A);1月23日至3月30日,树冠覆膜的果皮L*值高于对照,说明在树冠覆膜后期,能够延缓果皮亮度的下降速度。树冠覆膜和对照组的果皮红度a*值变化趋势一致(图1-B),且树冠覆膜的果皮 a*值在1月23日和3月16日分别达到20.17和19.85,显著高于对照(P<0.05),表明树冠覆膜的沙糖橘果皮更偏向于红色。图1-C表明树冠覆膜后期(32 d后)果皮泛黄,尤其是在2月28日和3月16日,树冠覆膜使代表黄色程度的b*值显著(P<0.05)高于对照组(分别为12.75、12.16和 11.37、10.75)。综合分析果皮的色差指标,留树保鲜到2月28日后,果面呈现亮度低、泛黄的表型;3月16日果面亮度L*和红色值a*略微上升可能是由于气温回暖,光照充足使其着色有所提高,试验数据结果符合当地当年的气候变化。
可溶性固形物和可滴定酸的含量及固酸比是衡量果实风味品质及成熟度的重要参数。由图2-A可看出,随着采收期的推迟,露地沙糖橘果实的可溶性固形物含量呈现先升后降趋势,树冠覆膜沙糖橘则逐步升高,由12月29日的最低值12.27%提高到3月 30日的 14.10%,7个采收时期都极显著(P<0.01)高于对照组。覆膜与对照的可滴定酸变化趋势基本一致,并且均在 2月28日达到峰值,分别为0.87%和0.80%(图2-B),随后迅速降低。通常有机酸含量高或有机酸降解缓慢的柑橘品种其保鲜性能较好,采后贮藏过程中有机酸的消耗是导致柑橘果实风味和品质下降的主要原因[16,20-21],有机酸是可滴定酸中的主要成分;可滴定酸的变化趋势暗示2月28日之后采收的沙糖橘果实品质和保鲜性能可能在下降。覆膜与对照的固酸比变化趋势总体一致,先降后升,并于2月28日降至最低,分别为 15.49、13.86,3月逐渐回升。树冠覆膜显著提高沙糖橘的可溶性固形物含量(1.37%—3.37%)、可滴定酸含量和固酸比(1.87—8.12),从而改善果实的风味品质。
为进一步探究树冠覆膜留树保鲜期间果实初生代谢物的变化情况,用 GC-MS检测沙糖橘树冠覆膜 7个采收时期果肉的初级代谢物含量。基于 GC-MS色谱图数据库及部分标样比对结果,在果实中共鉴定出37种常见的初生代谢物,包括12种氨基酸、7种有机酸、14种糖醇类以及4种脂肪酸。由图3-A可知,根据初生代谢物的变化趋势,聚类分析结果将不同处理、不同采收期的代谢规律为3类,类别Ⅰ为12月29日至2月3日4个采收期的对照和覆膜处理样品(除了2月3日采收的覆膜组),类别Ⅱ为2月28日至3月30日3个采收期所有的对照组和覆膜处理样品,类别Ⅲ为树冠覆膜后2月3日采收的果实单独归为一类。脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质,植物在遭受干旱、高盐、高低温以及重金属等胁迫时,通过增加脯氨酸合成以及减少脯氨酸降解来积累脯氨酸,以响应和适应逆境胁迫[22-24];图3-B表明在3个月的留树贮藏期间,脯氨酸呈现先上升后降低再升高的趋势,尤其是 2月 28日开始脯氨酸含量大幅度提高,在3月30日采收的对照组脯氨酸最高,覆膜后期脯氨酸的含量显著降低。γ-氨基丁酸(GABA)的富集与植物所经历胁迫应激反应有关,在受到低氧、低温、热、盐渗透、机械损伤等胁迫时,会导致GABA的积累[25-26]。随着留树贮藏时间的延长,GABA呈现逐渐积累的趋势;2月3日后,GABA积累速度加快,树冠覆膜后果实中GABA的含量整体低于对照处理。结果表明,2月上旬前果实初生代谢物的含量较为稳定,此后,大部分代谢物开始发生变化,导致果实初生代谢物整体异于前期。
呼吸速率的大小可反映植物体代谢活动的强弱及对自身能量物质的损耗速率,是评价果实贮藏性能的重要指标。图4结果表明,随着留树时间的延长,沙糖橘果实采后呼吸速率先加快后减弱,树冠覆膜与对照组都在2月3日达到峰值,分别为29.50 mL·kg-1·h-1、35.31 mL·kg-1·h-1;树冠覆膜的沙糖橘呼吸速率在测定的6个采收时期里有4个时期低于对照组,表明树冠覆膜能在一定程度上降低果实的呼吸速率,进而降低果实自身能量损耗。
腐烂率是评价果实贮藏性能以及保鲜效果的主要指标。如图5所示,12月29日采收的果实腐烂率最低,贮藏 60 d时覆膜和对照腐烂率分别为 3.61%和2.55%。随着采收期的推迟,树冠覆膜和对照组的沙糖橘果实腐烂率都在不同程度地升高;覆膜和对照在2月3日、2月28日、3月16日采收贮藏25 d后腐烂率分别为19.26%、32.06%、30.00%和35.68%、49.23%、47.65%;1月23日采收后贮藏60 d腐烂率都低于后面3个时期采后贮藏25 d的腐烂率。该结果表明树冠覆膜能够将采后腐烂率降低1.06%—17.65%,提高保鲜性能;但采收期的不合理延长,沙糖橘保鲜性能会降低,采后腐烂率升高。
果实失重率一定程度上代表着果实的皱缩程度和新鲜度,是评价果实贮藏性能的指标之一。图6表明,树冠覆膜一周,果实采后失重率差异不显著,分别为6.90%和6.37%;覆膜一定时间后(约15 d后),果实采后的失重率极显著低于对照(P<0.01),1月10日和1月23日覆膜的失重率分别低于对照3.44%、2.37%。表明树冠覆膜能显著降低果实水分散失速率,提高采后保鲜性能。
ABA是植物体内重要的应激激素,在调节植物的生长发育、气孔导度、果实成熟软化及色泽发育等方面起着重要作用,当植物受到胁迫,如低温、干旱、高盐等环境条件,及除草剂使用等都能影响植物体内ABA水平[27-28]。田间观察发现,相对于露天栽培的沙糖橘,树冠覆膜后土壤较为干燥,结合当地气候特点及栽培条件,推测树冠覆膜后形成相对干旱的环境可能会提高植株内源 ABA的含量,进而影响果实的品质和保鲜性能,因此本研究对果皮内源 ABA进行检测。图7表明,与对照相比,树冠覆膜初期(12月29日)果皮ABA含量差异不显著;1月10日和1月23日,树冠覆膜沙糖橘果皮 ABA含量分别比对照高15.04 和 13.48 ng·g-1。
果面蜡质层是果实适应和抵抗不良贮藏环境的第一道防线,蜡质的含量、组成对保持果实食用品质、降低失水速率和延长贮藏寿命具有重要意义[29-30]。覆膜后采后失重率下降,果面光泽度下降,而光泽度的下降往往是蜡质增厚的表现;同时也提高了 ABA含量,关于ABA调控植物表皮蜡质生物合成从而降低失水的研究已有相关报道[31],因此,探究果面蜡质成分的变化是对其相关表型差异的进一步解析。通过GC-MS和GC对采收期果实表皮的蜡质成分进行检测,鉴定到蜡质的主要 4大类成分,分别是直链的脂肪烷烃类、脂肪醛类、脂肪酸以及伯醇。图8-A内标法相对定量结果表明,树冠覆膜与对照的蜡质含量变化趋势基本一致,覆膜后蜡质增多,与对照相比,蜡质至少提高8.48%,且在多个采收时期显著高于对照。由图 8-B看出,沙糖橘果面蜡质主要以脂肪醛类为主(62.52%—75.00%),其次是烷烃(12.08%—22.16%)、脂肪酸(7.82%—12.54%)、伯醇(2.3%—3.93%)。树冠覆膜后,果面蜡质成分的比例变化不大。如图 8-C所示,树冠覆膜能够极显著提高烷烃的含量(碳原子数为23、25、27、29、31、33直链烷烃的总量)(P<0.01),显著提高部分采收时期蜡质中醛类(碳原子数为 24、26、28、30脂肪醛)和伯醇(碳原子数为24、26、28的伯醇)含量(P<0.05);而脂肪酸的含量(碳原子数为20、22、24、26、28的脂肪酸)差异不显著。因此,树冠覆膜显著提高沙糖橘果面的蜡质含量,蜡质总量提高 1.14—3.47 μg·cm-2。
树冠覆膜后,果面蜡质含量差异较大,因此选取3个采收期的果皮样品,通过RT-qPCR对已报道的蜡质合成相关基因定量分析。CER1以及KCS家族成员等都是被报道与蜡质合成相关的基因[32-33];CER2是负责C28—C30 VLCFA酰基链延伸的核心酶;羟酰辅酶脱水酶HCD为单基因编码,参与蜡质成分碳链延伸环节的脱水反应;MAH1是中链烷烃羟化酶相关基因,参与仲醇和酮类的合成。图 9表明,露地栽培的沙糖橘,其大部分与蜡质合成相关的基因随留树时间延长而表达量降低,该趋势符合前人连续 3年对柑橘整个发育时期蜡质含量变化的数据结果,即蜡质主要是在花后150—180 d大量合成[18]。CER1-1、CER1-3、CER2、HCD以及MAH1的表达量在覆膜中后期显著高于对照。蜡质是由多种成分组成的次生代谢物,在进化中属于非常保守的结构,由一系列酶催化合成,合成路径复杂,其含量的高低由多基因共同调控。总体上,树冠覆膜后的蜡质合成相关基因表达量高于对照,这与蜡质含量的变化趋势较为一致。
留树保鲜技术在我国应用广泛,主要方式有地膜覆盖、果实套袋、树冠覆膜以及露地留树保鲜等。广西桂林地区的沙糖橘直接引用地表覆膜技术并没有取得像三峡库区周边一样的应用效果,可能是由于三峡库区大水体周边的温度变化较为平缓、温差小,而广西桂林地区冬季多为阴雨天气,常遇偏北风,易形成冻雨。树冠覆膜属于简易的半封闭式温室大棚,具有避雨控湿、保温避寒、减少病虫害、减少裂果落果、延长果实市场供应期、提高经济效益等作用[34-36]。前人对金柑树冠覆膜并对采收期的品质分析结果表明,覆膜后果实可溶性固形物含量显著增加、可滴定酸含量下降[36];对沙糖橘覆膜试验结果表明,覆膜显著提高糖酸比、减少枝梢冻害发生率[35]。本研究对7个采收期、不同处理的沙糖橘品质和保鲜性能的变化趋势进行了研究,结果表明树冠覆膜和对照在留树保鲜期间,果实光泽度都逐渐下降,且覆膜果实光泽度高于对照,但随着覆膜后采收期的推迟,果皮色泽由前期的橘红色转为后期的橘黄色,色泽暗淡,此结果与前人报道基本一致[7,9,11];同时,树冠覆膜后果实可溶性固形物显著高于对照组,呈现先升高,3月中旬下降之后再上升的趋势。树冠覆膜能使果皮鲜亮,呈现橘红色,极显著提高果实可溶性固形物含量,分析其原因可能是,树冠覆膜改变了光照和树冠内的昼夜温差从而促进果实糖分积累与着色;王振兴等[36]研究表明清见橘橙树冠覆膜可以明显改善树冠内小气候,使树冠内温度升高,阴雨潮湿天气时覆膜能控制土壤湿度形成相对干旱的环境,晴天干旱时又能保持一定的湿度;范七君等[35]对金柑试验结果也表明覆膜降低了树冠的空气湿度,一定程度上加大了昼夜温差,增加叶面积和叶绿素含量从而保障光合同化物的积累。
广西桂林地区冬季多阴雨天气,湿度较大,树冠覆膜一定程度上控制土壤湿度形成相对干旱的环境,干旱促进植物 ABA的快速积累。ABA促进果实着色、果实品质提高及植物表皮蜡质合成已有相关报道[37-38],本研究对沙糖橘树冠覆膜后的果皮脱落酸含量进行了测定,结果也表明覆膜后果实ABA含量显著高于对照。植物表皮蜡质是覆盖在所有陆生植物与空气接触部位的一层疏水性的保护屏障,具有调节植物非气孔性失水、抵御极端温度、抵抗病原菌入侵等作用[39-44],果面蜡质的增多往往会降低水分的散失,普遍认为柑橘贮藏保鲜先保水。本研究中,树冠覆膜的果实失重率和采后腐烂率都显著低于对照,由此推测沙糖橘树冠覆膜后采后保鲜性能的改善可能与蜡质有关,前人的研究忽视了果面蜡质层的作用。本研究对蜡质检测结果表明 7个采收时期果面总蜡含量都显著高于对照,大部分蜡质合成相关基因的表达量也高于对照。结合前人和本研究结果,树冠覆膜改善沙糖橘果实品质及采后保鲜性能的原因,可能是通过树冠覆膜改善树冠内小气候,从而提高树体内源激素ABA含量,改善果实的着色、糖分的积累和果面蜡质的生物学特性;但ABA积累的量并没有促进果实的掉落,前人的研究结果表明柑橘树冠覆膜降低落果率[8,34],关于成熟果实落果生理机制较为复杂,具体有待进一步研究。
柑橘留树保鲜采收期应考虑果实的品质、采后保鲜性能、树体开花坐果时间等综合因素。牛英等[13]研究结果表明沙糖橘果实大小与留树时间的长短对果实浮皮程度均有显著影响,果实越大、留树保鲜时间越长,浮皮率越高,浮皮指数越大,浮皮越严重。生产实践表明酸含量高的柑橘品种其果实可以挂树贮藏到翌年四月底,柑橘采后贮藏过程中有机酸的消耗是导致果实风味品质下降的主要原因[20-21]。本研究中,果实可滴定酸在2月28日开始迅速下降,果实的固酸比从初期的22.30降至2月28日的15.49,果面光泽度 L*值也逐渐降低到 2月 28日的 69.96;1月23日、2月28日和3月16日3个采收期,果面颜色由鲜红色逐渐转为橘黄色再转为红色,对于沙糖橘这一品种,消费者更喜好红色外观;因此就果实内外部品质而言,沙糖橘不适宜晚于2月28日采收。覆膜后随着采收期的推迟,果肉初生代谢物逐渐发生变化,果实自身的呼吸强度呈现升高趋势;采后腐烂率逐渐增加,保鲜性能降低。桂林地区的沙糖橘开花时间多为3月下旬,树体开花需消耗大量的养分物质,若3月份揭膜采收会对当年的开花坐果有一定影响。
树冠覆膜能够提高沙糖橘内源性 ABA含量,提高果面蜡质含量,降低采后失重率和腐烂率;提高果实可溶性固形物、可滴定酸含量和固酸比,降低果实呼吸速率,改善外观品质使果皮色泽红艳;但采收期的不合理延长会大大降低果实品质和保鲜性能,广西桂林地区树冠覆膜的沙糖橘最晚采收期应控制在2月下旬前完成。