紫苏籽肽抗疲劳功效及其作用机理

魏 颖，郭 颖，李明亮，陈 亮，王雨辰，姜 盛*，谷瑞增*

（1中国食品发酵工业研究院有限公司 北京 100015 2华狐生物科技（中国）有限公司 沈阳 110000）

疲劳（Fatigue）是一种非特异性、多层面的症状，包含了生物、心理、社会和行为过程之间复杂的相互作用[1]。生理性疲劳分为中枢疲劳和外周疲劳两类，外周性疲劳又称慢性疲劳，主要指由肌肉本身，如能源不足、代谢物堆积等原因引起[2]。随着科技的发展，人们的工作和生活节奏不断加快，越来越多的人经受着疲劳的困扰。现代营养学研究认为，生物活性肽易被机体消化吸收，能有效改善细胞代谢，恢复机体生理环境，从而达到延缓疲劳的效果[3]。

近年来，通过营养干预缓解疲劳的研究受到越来越多的关注[4]。其评价方法主要采用灌胃方式，检测小鼠运动耐力及相关生化指标[5]。其中，应用较多的是小鼠负重游泳评价模型，以延长小鼠负重游泳时间来评价活性物质的抗疲劳功效[6]。根据能源耗竭学说和代谢物质堆积学说，与疲劳相关的生化指标主要包括肌/肝糖原含量、BLAS、BUN、LDH 水平等[7]。目前有关活性肽的抗疲劳作用已有报道。例如，草鱼抗疲劳肽能够增加机体糖原储备，减少代谢物的堆积[8]；Liu 等[9]发现花生肽也能增强小鼠运动耐力，对调节糖代谢，减少乳酸积累有明显的作用。

紫苏[Perilla frutescens（L.） Britt.]是一种唇形科紫苏属一年生草本植物，主要种植在亚洲国家，如中国、印度、日本、越南、泰国等[10]。在我国，紫苏已有两千多年的种植历史[11]。紫苏籽、根茎、叶片等都富含多种营养成分和活性物质，紫苏籽脂肪酸含量高，其油酸、亚油酸、亚麻酸总含量约占总脂肪酸的93%[12]。紫苏籽的蛋白质含量约为25%，氨基酸种类丰富且组成合理[13]。目前，对紫苏油开发利用比较广泛，然而对紫苏分离蛋白和紫苏肽的开发不足。本文采用双酶解法制得紫苏籽肽，研究其抗疲劳活性及作用机理，为高值化利用紫苏籽肽提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物：雄性SPF 级ICR 小鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠饲养环境：温度（22±2）℃，相对湿度50%～70%，自由饮水、进食，光照循环12 h 亮/暗。

材料与试剂：紫苏籽蛋白粉，黑龙江珍爱生物科技有限公司；中性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g），南宁庞博生物工程有限公司；血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、血乳酸（Blood lactic acid，BLA）、肝糖原（Liver glycogen，LG）、肌糖原（Muscle glycogen，MG）、乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒，南京建成生物工程研究所；乳清蛋白，上海源叶生物科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

酶标仪，美国贝克曼；Millipore Elix 15 纯水仪，默克化工有限公司；UV-755B 紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；ST2100 实验室pH 计，奥豪斯仪器（常州）有限公司；EL104 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LG-5真空冷冻干燥机，上海市离心机械研究所；HYP消化炉，上海纤检仪器有限公司；80-2 离心沉淀器，江苏省金坛市医疗仪器厂；79-1 磁力加热搅拌器，国华电器有限公司；JB90-D 型强力电动搅拌机，上海标本模型厂；电子万用炉，北京市永光明医疗仪器厂；玻璃游泳缸（80 cm×80 cm×70 cm），厦门美成展示设备有限公司；WB-10L1 恒温水浴锅，德国Memmert 公司。

1.3 方法

1.3.1 紫苏籽肽的制备 将紫苏籽蛋白粉以1∶15 的固液比混合匀浆，调pH 值至7.0，加热至50℃后，按1 g/L 的质量浓度加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物（中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1∶1），在50 ℃下搅拌2 h，灭酶；离心收集上清液，调pH 值至6.0 后用陶瓷膜过滤，得到一级过滤液；然后采用Cl 型阴离子交换树脂吸附滤液中带负电的短肽及氨基酸；过纳滤膜，并收集截留液，得到二级过滤液；经减压浓缩，硅藻土过滤，喷雾干燥后得到紫苏籽肽。

1.3.2 紫苏籽肽主要成分测定 水分含量采用105 ℃恒重法，依照GB 5009.3-2016 方法测定[14]；灰份含量采用550 ℃灼烧法，依照GB 5009.4-2016 方法测定[15]；蛋白质含量测定采用凯氏定氮法，依照GB/T 5009.5-2016 方法测定[16]；多肽含量采用三氯乙酸法[7]；游离氨基酸含量测定参照GB/T 5009.124-2016 方法[17]。

1.3.3 动物实验分组及给药剂量 适应性饲养1周后，将小鼠随机分为5 组，每组10 只，并记录初始体重。5 组分别为空白对照组（Control）、阳性对照组（WP）、低剂量组（LP）、中剂量组（MP）、高剂量组（HP）。阳性对照组为乳清蛋白，灌胃剂量为0.8 g/（kg·d）；紫苏籽肽低、中、高剂量组剂量分别为0.4，0.8，1.2 g/（kg·d）；空白对照组给予等体积的蒸馏水。小鼠灌胃体积为0.2 mL/只，灌胃期间，小鼠自由摄食、饮水，实验周期为28 d。

1.3.4 小鼠负重游泳实验 采用Wei 等[12]的方法并稍作修改：末次灌胃30 min 后，在小鼠尾中负荷体重5%的铅丝，放入装有（30±3）℃温水的玻璃游泳槽中，开始计时，不时搅动水，使小鼠保持四肢运动。直至小鼠的头部沉入水中，经7 s 仍不能返回水面停止计时，记为小鼠的负重游泳时间。

1.3.5 抗疲劳生化指标测定 将负重游泳的小鼠吹干，休息30 min 后处死，取肝脏和腿部腓肠肌，用生理盐水洗净，滤纸吸干，根据试剂盒检测方法测定肌糖原、肝糖原含量。

末次灌胃30 min 后，小鼠不负重于（30±3）℃温水中游泳60 min，将小鼠从水槽中捞出并吹干，休息30 min 后，取血。取部分全血，按照BLA 试剂盒方法分析BLA 含量。剩余血液室温静置30 min后，3 000 r/min 离心15 min，取上清液，按照试剂盒方法检测BUN 含量和LDH 活力。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 紫苏籽肽主要成分测定

所制备的紫苏籽肽的成分分析如表1所示。其中，总蛋白质含量为87.70%，灰分含量为6.21%，总游离氨基酸含量为5.87%，小肽含量为78.05%，分子质量低于1 000 u 的短肽含量达到80.12%。

表1 紫苏籽肽的主要成分分析Table 1 The main components of Perilla frutescens seed peptides

2.2 紫苏籽肽对小鼠体重的影响

紫苏籽肽对小鼠体重的影响如表2所示。结果表明，与空白对照组和阳性对照组相比，紫苏籽肽各剂量组小鼠的体重变化趋势大致相同，无显著差异（P＞0.05）。说明摄入紫苏籽肽的小鼠生长正常，不会引起肥胖。

表2 紫苏籽肽对小鼠体重的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Perilla frutescens seed peptides on body weight in mice（±s，n=10）

表2 紫苏籽肽对小鼠体重的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Perilla frutescens seed peptides on body weight in mice（±s，n=10）

组别 0 周 1 周 2 周 3 周 4 周空白对照组 26.94±0.56 30.76±1.13 32.31±0.55 32.25±1.24 34.38±1.66阳性对照组 26.40±1.86 28.45±1.97 32.15±2.24 33.13±1.66 34.88±1.73低剂量组 26.59±0.33 26.10±1.04 30.11±1.07 31.49±0.96 33.70±1.15中剂量组 27.30±0.25 27.95±0.13 32.74±1.37 33.04±1.07 36.34±1.77高剂量组 26.16±0.65 27.21±0.74 31.01±0.76 32.45±0.64 36.00±0.32

2.3 紫苏紫肽对小鼠负重游泳时间的影响

实验结果如图1所示。灌胃紫苏籽肽28 d后，低、中、高剂量组小鼠负重游泳时间较空白对照组分别提高了10.61%，22.76%，56.14%。其中，高剂量组负重游泳时间到达116.40 min，显著高于阳性对照组的104.19 min（P<0.05）。此外，随着紫苏籽肽剂量的增加，小鼠负重游泳时间越长，说明紫苏籽肽抗疲劳活性存在明显的量效关系。

图1 紫苏籽肽对小鼠负重游泳时间的影响（n=10）Fig.1 Effect of Perilla frutescens seed peptides on weight loading swimming time of mice（n=10）

2.4 紫苏籽肽对小鼠BUN 水平的影响

如图2所示，灌胃28 d 后，紫苏籽肽低、中、高剂量组中BUN 水平均显著（P<0.05）低于空白对照组。与此同时，紫苏籽中、高剂量组BUN 水平（11.40±0.16）mmol/L 和（11.12±0.31）mmol/L 也显著（P < 0.05）低于阳性对照组（12.56±0.26）mmol/L。结果表明，紫苏籽肽能有效促进BUN 在体内的分解代谢，其效果更优于乳清蛋白。

图2 紫苏籽肽对小鼠尿素氮（BUN）水平的影响（n=10）Fig.2 Effect of Perilla frutescens seed peptides on BUN level in mice（n=10）

2.5 紫苏籽肽对小鼠肌糖原、肝糖原含量的影响

连续灌胃28 d 后，紫苏籽肽高剂量组肌糖原、肝糖原含量分别为（1.63±0.01）mg/g、（13.11±0.36）mg/g，显著（P<0.05）高于阳性对照组的（1.56±0.05）mg/g 和（9.07±0.56）mg/g（图3）。与空白对照组相比，紫苏籽肽高剂量组肌糖原、肝糖原含量分别提高了117.33%，89.73%。结果说明，紫苏紫肽能有效提高肌糖原和肝糖原的积累，从而增加了机体的能量供给。

图3 紫苏籽肽对小鼠肌糖原含量（a）和肝糖原含量（b）的影响（n=10）Fig.3 Effect of Perilla frutescens seed peptides on muscle glycogen content（a）and liver glycogen content（b） in mice（n=10）

2.6 紫苏籽肽对小鼠BLA、LDH 水平的影响

如图4所示，紫苏籽肽各剂量组LDH 活性均高于空白对照组。相应地，紫苏籽肽中、高剂量组BLA 水平分别为（5.89±0.31）mmol/L 和（5.73±0.20）mmol/L，较空白对照组（8.56±0.15）mmol/L 均显著降低（P<0.05）。本研究结果显示，紫苏籽肽可以提高LDH 活力，降低BLA 堆积，从而有效提高机体抗疲劳效果。

图4 紫苏籽肽对小鼠LDH（a）和BLA（b）水平的影响（n=10）Fig.4 Effect of Perilla frutescens seed peptides on LDH（a） and BLA（b） levels in mice（n=10）

3 结论与讨论

本研究发现：灌胃低、中、高3 个剂量紫苏籽肽4 周后，小鼠负重游泳时间分别提高了10.61%，22.76%，56.14%，与作用浓度呈正相关，显著提升了小鼠的运动能力。在抗疲劳机理研究方面，在机体运动过程中肌糖原首先被消耗，肝糖原继而被消耗供能，因此，糖原消耗量与疲劳程度密切相关[18]。与空白对照组相比，紫苏籽肽高剂量组肌糖原、肝糖原含量分别提高了117.33%和89.73%，有效增加肌肉和肝脏糖原的积累，从而为机体运动提供了更多能量。

当机体氧气供给不足时，肌肉有氧活动转化为厌氧代谢，导致乳酸积累[19]。乳酸含量的增加会影响循环系统和骨骼肌系统功能，导致肌肉运动能力下降[20-21]。而LDH 可以促进肌肉中过多的乳酸转变为丙酮酸，减少乳酸积累，延缓疲劳[22]。本研究得出，3 个剂量的紫苏籽肽均可显著提高机体LDH 活力。在运动过程中，明显加快了血液中的BLA 和BUN[23]的分解代谢，效果均优于阳性对照乳清蛋白组，延缓了肌肉运动能力的下降[24]。

综上所述，本研究采用酶解制备的紫苏籽肽能够通过增加机体糖原积累，提高LDH 活性，促进代谢产物的清除，从而有效提高小鼠的运动能力，具有良好的抗疲劳效果。