鸡大肠杆菌与葡萄球菌的防治研究

林松泉，庄若飞，邹文政

（1.厦门惠盈动物科技有限公司，福建 厦门 361023；2.集美大学水产学院，福建 厦门 361021）

禽流感、新城疫等疾病的发生，不同程度影响着我国养鸡业的正常发展[1]。某养鸡场鸡群突发疾病，其主要症状为：嘴巴常张开，体温升高，精神沉郁，食欲降低或停食，拉灰白色稀便，且传染快、发病急、病程短、死亡率高。分别从头、肺、肝、脾脏等4种器官通过分离纯化病菌，得到两株病原菌，经鉴定分别为大肠杆菌（Escherichia coLi）与鸡葡萄球菌（StaphyLococcus gaLLinarum）。

关于鸡大肠杆菌与葡萄球菌感染防治的报道很多[2-9]，但涉及的葡萄球菌主要是金黄色葡萄球菌(Staphy Lococcus aureus)，而鸡葡萄球菌（Staphy Lococcus gaLLinarum）的感染未见相关报道。如ELsaid[10]从多个农场鸡体内分离出700多株致病菌，其中葡萄球菌占45.5%。此外，关于鸡疾病的治疗基本以抗生素药物为主导，然而，对于经常使用大量抗生素治疗病菌引起的疾病，往往会产生多种负面影响，如导致病原菌耐药性提高、免疫机能下降、药物残留与破坏生态环境等[11]。人们食用含抗生素的畜禽产品则会对人体健康产生危害[12-13]，而随着农业部提倡限抗减抗的要求与益生菌产品的开发研究，多数益生菌产品可以有效抑制病原菌，起到防治病原菌的作用。因此，其越来越受到人们的广泛关注。

本研究从市场获得10个含抗生素产品，涉及硫氰酸红霉素、酒石酸泰乐菌素、替米考星、阿莫西林、氟苯尼考、盐酸多西环素及延胡索酸泰妙菌素7种常用抗生素，分别对分离的两株菌进行药敏试验，能有效抑制这两种菌的抗生素产品仅为盐酸多西环素。通过使用实验室益生菌对这两株病原菌进行抑菌筛选试验，其中植物乳杆菌（LactobaciLLus pLantarum）、干酪乳杆菌（LactobaciLLus casei）、鼠李糖乳杆菌(LactobaciLLus rhamnosus)与酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）对这两株菌均有抑制作用，这为鸡病的防治提供了新的方向，也为益生菌产品的开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病样由某鸡养殖场提供，共5组平行样，每组平行样中分别包括头、肺、肝及脾脏（见图1）。

图1 病鸡组织器官

供试药物。市场上得到的10个含抗生素产品，酒石酸泰乐菌素(A公司)（规格：5000万单位）、酒石酸泰乐菌素(B公司)（规格：2000万单位）、替米考星（规格：10%）、硫氰酸红霉素可溶性粉(A公司)（规格：500万单位）、硫氰酸红霉素可溶性粉(B公司)（规格：500万单位）、硫氰酸红霉素（C公司）（规格500万单位）、延胡索酸泰妙菌素（规格：45%）、阿莫西林（规格：10%）、氟苯尼考（规格：10%）、盐酸多西环素（规格：10%），共涉及7种抗生素。

供试益生菌。解淀粉芽孢杆菌（BaciLLus amyLoLiquefaciens）（BNCC 185324）、纳豆芽孢杆菌（BaciLLus natto）（BNCC 336388） 购买于北纳创联生物技术有限公司；枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）、地衣芽孢杆菌（BacLicusLincheniformis）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas paLustris）、啤酒酵母菌（S.cerevisiae）、植物乳杆菌（L.pLantarum）、干酪乳杆菌（L.casei）与鼠李糖乳杆菌(LactobaciLLus rhamnosus)均为本实验室分离保存。

1.2 病原菌分离与鉴定

从5组平行样病样中随机选取3组在超净工作台上操作，用灼热的刀片烫死表面杂菌，再通过无菌操作将病鸡的组织采用平板划线法分离病原菌，头、肺、肝及脾脏各1个平板，共使用12个平板，倒置于37℃培养箱中隔夜培养，长出单菌落后再划线纯化培养。将纯化后的菌株采用16S rRNA细菌通用引物[14]进行扩增，正向引物为27F：5'-GAGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。所得序列经NCBI（美国生物技术信息中心）数据库的BLAST进行在线同源性比对。

1.3 药物敏感性试验

采用试管二倍稀释法进行操作。以药物标注的使用浓度为参考，设为第一浓度梯度（最低浓度），往后按二倍梯度提高浓度，设置6个稀释度梯度。即往第1支无菌的小试管（15×100）中加入1 mL营养肉汤培养基，再加入1 mL产品母液，混匀，从第1支试管吸取1 mL混合物到第2支含1 mL营养肉汤培养基试管，以此类推，直到第6支试管，并从第6支试管吸取1 mL液体弃去。然后分别向试管中加入0.1 mL菌液（108CFU·mL-1），于 37 ℃培养箱中培养 24 h（对照组为1 mL营养肉汤培养基加0.1 mL菌液），观察是否长菌。

1.4 益生菌抑菌试验

采用管碟法[15-16]并稍加改进。取1 mL病原菌悬液加入50℃ 100 mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中摇匀（菌终浓为 105CFU·mL-1），倒入培养皿中（厚度约为3 mm），待冷却凝固后将牛津杯置于平板中，向牛津杯中加入0.25 mL益生菌菌液 （浓度为108CFU·mL-1），置于37℃下培养24 h。观察有无抑菌圈产生，并用游标卡尺测量抑菌圈的直径。

1.5 益生菌免疫保护试验

将60只45日龄健康鸡分成6组，每组10只，分别为对照组1、对照组2，大肠杆菌感染组1、大肠杆菌感染组2和鸡葡萄球菌感染组1、鸡葡萄球菌感染组2，其中组别2为益生菌保护组。感染组皮下注射分离菌 1 mL（浓度为 108CFU·mL-1）、对照组 1、对照组 2注射1 mL 0.85%生理盐水；益生菌保护组饮水中加入酵母菌和乳酸菌等益生菌，连续观察10 d。

2 结果

2.1 病原菌的分离

在3组平行样的头、肺、肝、脾脏中，只有肺平板均分离出细菌。通过菌落形态观察，有2种不同形态的菌，一种为浅白色、半透明的菌落，一种为淡黄色、不透明的菌落（见图2）；通过革兰氏染色，镜检结果表明，浅白色的为杆菌、阴性菌（见图3），淡黄色的为球菌、阳性菌（见图4）。分别标注为1号菌、2号菌。

图2 病鸡肺分离菌平板

图3 肺部分离1号菌(革兰氏阴性杆菌)

图4 肺部分离2号菌(革兰氏阳性球菌)

2.2 菌种测序鉴定

将纯化好的这两株病原菌进行菌种测序鉴定，菌株基因系列如下：

1号菌株通过测序得到16S rRNA片段长度为1417 bp，具体测序系列结果为：

2号菌株通过测序得到16S rRNA片段长度为1434 bp，具体测序系列结果为：

两个菌株基因系列通过NCBI采用BLAST软件进行菌株同源性比对，1号菌与Escherichia coLi AH01的核苷酸序列同源性为 99.93%，2号菌与StaphyLococcus gaLLinarum LMG19119的核苷酸序列同源性为100%。

2.3 药物敏感性试验结果

不同浓度的10种市场药物产品（7种药物）对大肠杆菌和鸡葡萄球菌两株分离菌的抑菌结果分别见表1和表2。

表1 10种市场药物产品对大肠杆菌的抑菌性

表2 10种市场药物产品对鸡葡萄球菌的抑菌性

从表1和表2可以看出，在药品试验浓度范围内，酒石酸泰乐菌素、替米考星、硫氰酸红霉素、延胡索酸泰妙菌素和氟苯尼考等5种抗生素对大肠杆菌与鸡葡萄球菌无抑菌效果；阿莫西林产品用量为正常标签用量的8倍及以上才能抑制大肠杆菌的生长，而对鸡葡萄球菌则无抑制作用；盐酸多西环素产品能有效抑制大肠杆菌生长，若对鸡葡萄球菌起抑制作用则需正常标签用量的8倍及以上。

2.4 益生菌的抑菌效果

枯草芽孢杆菌等9种益生菌对大肠杆菌和鸡葡萄球菌两株分离菌的抑菌结果分别见表3和表 4。

表3 9种益生菌对大肠杆菌的抑制效果

从表3和表4可以看出，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌等5种益生菌对大肠杆菌和鸡葡萄球菌均无抑制作用；啤酒酵母菌对鸡葡萄球菌具有抑制效果，但对大肠杆菌无抑制作用；植物乳杆菌、干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌能够有效抑制大肠杆菌和鸡葡萄球菌，抑菌圈非常明显。

表4 9种益生菌对鸡葡萄球菌的抑制效果

2.5 分离菌株致病性和益生菌免疫保护结果

分离菌的致病性和益生菌的保护试验结果见表5。

表5 两株分离菌的致病性和益生菌的保护

从表5可以看出，两株分离菌对鸡均有不同程度的致病性，其中大肠杆菌致病性较弱，在注射感染7 d内死亡率为40%，鸡葡萄球菌致病性很强，在注射感染7 d内死亡率为100%。但是，在饮用水中添加益生菌后，注射感染大肠杆菌组未见鸡死亡；注射感染鸡葡萄球菌组死亡率明显下降，死亡率为20%。

3 讨论

在鸡养殖业中由大肠杆菌引发的疾病普遍存在，且危害较为严重，严重时死亡率高达50%。如何有效防控该病的发生已经成为一种重要关键的技术问题[18]。经过对病样的分离纯化、菌种鉴定，初步判断鸡的死亡很有可能是由大肠杆菌与鸡葡萄球菌感染导致的。国内外关于鸡感染葡萄球菌的文献[4-6]很多，但主要集中在金黄色葡萄球菌，对鸡葡萄球菌的研究未见报道。

经药敏试验发现，市场上10个畜禽产品（涵盖7个抗生素）替米考星、氟苯尼考等5种抗生素在试验药物浓度范围内对大肠杆菌与鸡葡萄球菌无抑菌效果；阿莫西林等产品需要较高剂量才有抑制作用，这表明抗生素的长期使用提高了大肠杆菌和葡萄球菌等病原菌的耐药性[19-21]。盐酸多西环素等产品能有效抑制大肠杆菌生长，但对鸡葡萄球菌起抑制作用则需正常药剂的8倍及以上。这表明，抗生素对病原菌的抑制作用具有一定的局限性，在用药过程中需对因用药，建议先做药敏试验，避免滥用抗生素。

益生菌是有利于宿主健康的单细胞微生物或组成明确的混合微生物[22]，能调节肠道菌群平衡，增强机体免疫力等，其中乳酸菌除了能够调节肠道微生物群平衡，产生抗菌物质，抑制有害细菌的生长，还能定殖于肠道[24-27]。在家禽养殖中，可有效维持动物肠道菌群平衡，抑制有害细菌的产生，减少疾病的发生[28]。通过对实验室9种益生菌菌株的筛选，得到4株可以抑制病原菌的益生菌，其中啤酒酵母菌对鸡葡萄球菌具有抑制效果，但对大肠杆菌无抑制作用；植物乳杆菌、干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌和鸡葡萄球菌具有明显的体外抑制效果；益生菌保护试验也进一步表明，在饮用水中添加酵母菌和乳酸菌能够有效防止大肠杆菌和鸡葡萄球菌的感染。有研究表明[29-30]，酵母菌与病原菌之间主要通过营养与空间的竞争而产生拮抗作用；干酪乳杆菌、植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌则通过产生抗菌肽来达到抑制病原菌[31-35]。根据这4株菌抑菌效果和相关抑菌机制，我们将进一步检测益生菌对其他致病菌的抑制效果，同时优化菌种复配和发酵培养条件，为益生菌产品的开发奠定良好的基础。

4 结论

从病鸡肺分离得到的两株病原菌分别为大肠杆菌与鸡葡萄球菌，对市场上10个畜禽抗生素产品具有较强的耐药性。益生菌（植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌与酵母菌）在体外对大肠杆菌与鸡葡萄球菌具有良好的抑制作用。因此，在生产实际运用过程中，建议先做药敏试验，对症用药，同时使用益生菌产品代替抗生素产品，避免抗生素滥用。