真实世界中新型冠状病毒抗体检测结果的探究

戴菊华，林博之，孙新平

本文的创新点：

该研究针对新型冠状病毒肺炎（COVID-19）早期，采用胶体金法进行新型冠状病毒抗体检测，临床中确实有部分受检者出现假阳性结果，提出嗜异性抗体这一较明确的干扰因素，对临床有一定的价值。

本文的局限性：

（1）由于本中心不是COVID-19定点医院，纳入的COVID-19确诊病例数仅1例，仅是单中心研究，多中心研究扩大样本量会不会出现结果差异，尚需要进一步深入研究。（2）未被嗜异性抗体阻断试管（HBT）封闭住的抗体阳性患者可能还存在其他潜在未明确的干扰因素，造成假阳性结果，需进一步研究。

国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》诊断标准［1］提及新型冠状病毒肺炎（COVID-19）确诊病例在原有核酸检测和测序基础上增加血清学检测作为依据，并通过检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）特异性抗体来辅助诊断COVID-19。SARS-CoV-2抗体的检测属于血清学检测的一种，包括胶体金法、化学发光法，抗体检测对临床实验室的操作要求相对于核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在二级以下的基层实验室完成。因现状是可用于SARS-CoV-2抗体检测的试剂较少，而胶体金法操作便捷，只需15 min判读结果，胶体金法被认为是在快速筛查SARS-CoV-2感染中有效的方法［2］。目前批准应用的抗体检测试剂盒中，基于抗体的免疫学方法存在相当比例的假阳性情况，因此检测试剂盒质量和检测过程的质量控制均十分重要［3］。抗体检测结果假阳性可能包括患者自身因素、试剂原因以及标本处理不当等原因。嗜异性抗体、类风湿因子、补体、自身抗体、血浆纤维蛋白等患者自身因素可能造成抗体检测结果假阳性，也有可能因为试剂盒抗原的特异性或抗原提取的纯度欠佳造成抗体检测结果假阳性。故特异性免疫球蛋白M（IgM）/免疫球蛋白G（IgG）抗体必须进行两次以上的动态检测，才能够成为COVID-19在病毒核酸检测阴性情况下辅助的确诊标准［4-5］。目前北京大学国际医院大多采用核酸联合胶体金法抗体检测用于复工复产体检及入院患者的筛查。在控制好试剂和标本因素的前提下，本文将对北京大学国际医院SARS-CoV-2 IgM和/或IgG抗体结果阳性，但核酸检测结果阴性患者的临床资料进行总结，探究SARS-CoV-2抗体检测结果假阳性的原因。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2020年3—6月北京大学国际医院同时送检SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体和核酸的8 678例受检者的临床资料进行回顾性分析，其中男3 968例、女4 710例。患者主要来自发热门诊、消化内科、急诊科、产科、口腔科等科室。排除标准：只检测SARS-CoV-2抗体或核酸其中一项者。本研究经北京大学国际医院伦理审查委员会审核通过〔伦理批件号：2020-043（BMR）〕。

1.2 资料收集 收集受检者临床资料，包括流行病学史、临床表现、实验室检查指标（SARS-CoV-2抗体和核酸检测结果、类风湿因子、补体、免疫球蛋白）。

1.3 研究方法

1.3.1 试剂与仪器 SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测采用胶体金法，抗体检测试剂购于珠海丽珠试剂股份有限公司和北京英诺特生物技术有限公司。丽珠试剂所测结果由GS1201胶体金试纸分析仪自动判读，仪器采用单反射光原理并综合光电技术，获取试纸条表面反射的信号，判读值≥0.230 0时判断为阳性，＜0.230 0为阴性。抗体阳性复核采用磁微粒化学发光法，仪器采用Wan200+全自动化学发光免疫分析仪（仪器和配套试剂均购于厦门万泰凯瑞生物技术有限公司），样本S/CO＜1.0时，SARS-CoV-2抗体检测结果判定为阴性；S/CO≥1.0时，SARS-CoV-2抗体检测结果判定为阳性。核酸提取试剂购于常州金麦格生物技术有限公司，SARS-CoV-2核酸检测采用荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，试剂（PCR-荧光探针法）购于圣湘生物科技有限公司和北京卓诚惠生生物科技股份有限公司。PCR扩增采用罗氏Z480荧光PCR仪。嗜异性抗体阻断试管（HBT）采用Scantibodies Laboratory Inc.，Heterophilic Blocking Tube，HBT-3IX762，批号：LSFF0041A。

1.3.2 标本采集 研究对象均采集空腹静脉血5 ml，置于含分离胶的黄头真空采血管内，充分混匀后静置待血液凝固，2 500×g离心5 min。标本无溶血、被细菌污染、贮存时间过长、凝固不全等现象。采集研究对象咽拭子标本，采用一次性病毒采样管，购于山东威高集团医用高分子制品股份有限公司，型号：MHII型（含灭活剂，2个拭子），规格3.5 ml，进行SARS-CoV-2核酸检测。

1.3.3 血清学检测 样本血清检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体按照试剂盒说明书进行，丽珠和英诺特试剂二者检测结果均为阳性则认为SARS-CoV-2抗体阳性，抗体阳性采用磁微粒化学发光法复核。

1.3.4 SARS-CoV-2核酸检测 采用RT-PCR技术，针对SARS-CoV-2基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N）基因进行检测。咽拭子标本和阴性、阳性质控品的RNA抽提严格按照试剂说明书进行。核酸检测结果Ct值判读以厂家说明书建议为准，对圣湘生物科技有限公司和北京卓诚惠生生物科技股份有限公司两个厂家的试剂盒检测核酸结果不一致的可疑结果应送疾病预防控制中心进一步确认。

1.3.5 HBT使用方法 每个样品用一个HBT，保持直立，轻弹底部，使管内试剂全部聚集到底部。取下瓶盖，吸取500 μl受检者样品加入试管底部，每个样本更换一次吸头，避免交叉污染，盖好盖子，轻轻翻转震荡5次，使样品与试剂充分混合（每管中含有足够的试剂，能灭活500 μl样品中的嗜异性抗体），室温孵育1 h。检测处理后样本，得到无嗜异性抗体干扰结果。

1.4 统计学方法 采用Excel进行数据录入和统计学描述，计数资料以相对数表示。

2 结果

2.1 SARS-CoV-2抗体和核酸结果 8 678例受检者中，8 677例SARS-CoV-2核酸检测阴性，其中胶体金检测SARS-CoV-2 IgM抗体阳性者25例（0.288%），SARSCoV-2 IgG抗体阳性者5例（0.058%），SARS-CoV-2 IgM和SARS-CoV-2 IgG抗体同时阳性者0例；使用化学发光法复核后，仅3例（0.035%）SARS-CoV-2 抗体阳性，其中1例为胶体金法SARS-CoV-2 IgM抗体阳性（浓度：2.14 COI），2 例为胶体金法 SARS-CoV-2 IgG抗体阳性（浓度分别是：159.47 COI和 352.10 COI），其余27例均为阴性（0.311%）。1例受检者SARSCoV-2核酸检测阳性，N基因Ct值为26.18，ORF1ab基因Ct值为26.77，同时抗体IgM和IgG均为阴性，详见表1。

表1 SARS-CoV-2抗体（胶体金法）和核酸检测结果分析Table 1 SARS-CoV-2 antibody （colloidal gold method） and nucleic acid detection result analysis

2.2 SARS-CoV-2抗体阳性（胶体金法）受检者的临床特征分析及动态监测 分析30例SARS-CoV-2抗体阳性受检者的临床表现和流行病学史，30例受检者均无流行病学史，其中有4例来自发热门诊，分别是3例系统性红斑狼疮（systemic lupus erythemlatosus，SLE）患者和1例化脓性扁桃体炎患者。其余26例临床上无发热症状，无COVID-19影像学特征，无淋巴细胞数目减少，不属于疑似病例。30例SARS-CoV-2抗体阳性者进行动态监测，其中有10例IgM 抗体阳性是住院患者，进行2次以上动态监测结果仍为阳性，其余20例是门急诊患者，未进行动态监测。

2.3 SARS-CoV-2抗体阳性（胶体金法）受检者的类风湿因子、补体、免疫球蛋白水平分析 分析30例SARS-CoV-2抗体阳性（胶体金法）受检者的类风湿因子、补体、免疫球蛋白的数据，结果发现，患者的类风湿因子水平均在参考范围内（＜10.1 U/ml）。除1例SLE患者疾病活动期补体C3降低外，其他29例受检者补体 C3（0.9～1.8 g/L）、C4（0.1～0.4 g/L）水平均在参考范围内。3例SLE患者的IgG抗体水平稍升高（分别为 17.74 g/L、20.03 g/L、21.36 g/L），其余患者的 IgG（7.0～16.0 g/L）和 IgM（0.4～2.3 g/L）均在参考范围内。

2.4 HBT对SARS-CoV-2抗体阳性结果的影响 嗜异性抗体是一种内源性干扰抗体，可与其他种属的免疫球蛋白结合，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，产生的途径包括动物细胞辅助治疗、注射疫苗、免疫抑制药物、输血、自身免疫性疾病、感染等，在体内相对稳定存在，具备一定的浓度，通常无病理生理作用，但在免疫学方法检测中是重要的干扰因素［6］，普通人群嗜异性抗体的发生率为0.17%～40.00%［7］。采用HBT对SARSCoV-2抗体阳性（胶体金法）的标本进行处理后，25例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性的标本中，除1例结果仍为阳性外（判读值由0.302 1降为0.241 6），其余结果均转为阴性（判读值 ＜0.230 0），而 SARS-CoV-2 IgG抗体阳性的结果均依然为阳性（判读值＞0.230 0）。其中临床上进行2次以上动态监测的10例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性的标本经HBT处理后均为阴性。

3 讨论

抗体检测结果假阳性或核酸检测结果假阴性存在，均是无法完全避免的，因此建议为满足临床诊断的特异度和灵敏度时，可以联合运用抗体筛查和核酸检测方法，实现SARS-CoV-2感染的快速筛查与鉴别［8-10］。实验室SARS-CoV-2核酸和抗体的检测结果是COVID-19临床诊断的重要依据，但临床依然需要根据流行病学史、临床症状及实验室检测结果综合判断，不能仅靠单一实验结果，尤其要考虑抗体假阳性的可能。

30例采用胶体金法检测SARS-CoV-2抗体阳性的受检者均无流行病学史，且同时SARS-CoV-2核酸检测结果均为阴性，排除感染SARS-CoV-2或既往感染SARS-CoV-2的可能，因此本研究认为这30例抗体检测结果为假阳性。嗜异性抗体干扰免疫学方法检测的原理是在抗原不存在的情况下，嗜异性抗体可与试剂中抗体Fc或者F（ab）段的决定簇非特异性结合，桥接捕获抗体和检测抗体，从而干扰免疫反应，使得结合到固相的标记抗体浓度升高，造成假阳性结果［6，11-12］。本研究采用HBT对30例胶体金法检测SARS-CoV-2抗体阳性的标本进行处理后重新再检测，其中24例抗体转为阴性。可能有一些样品具有很高浓度的嗜异性抗体干扰，在这种情况下，HBT可能无法完全阻断嗜异性抗体干扰。应该设计不同浓度梯度的嗜异性抗体封闭剂，但本研究所用HBT说明书提示每管中含有足够的试剂，能灭活500 μl样品中的嗜异性抗体，因此未进行倍比稀释。本研究着重分析了没有被HBT封闭住的1例IgM阳性和5例IgG阳性的受检者，没有被HBT封闭住的1例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性者是一名女性，77岁，合并患有高脂血症、高血压、脑梗死、动脉粥样硬化等多种基础疾病，因白内障待行人工晶状体植入术就诊，无发热和/或呼吸道症状等COVID-19相关临床表现，无COVID-19影像学特征，无淋巴细胞数目减少，既往未感染SARS-CoV-2，因此可以排除感染SARS-CoV-2。5例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性者中1例以发热、咽痛起病，临床诊断为化脓性扁桃体炎，抗生素治疗后好转，排除感染SARS-CoV-2或既往感染SARS-CoV-2可能，其余4例受检者临床上无发热症状，无COVID-19影像学特征，无淋巴细胞数目减少。以上6例受检者均无流行病学史，且做SARS-CoV-2抗体检测的同时均采样进行SARS-CoV-2核酸检测，检测结果均为阴性。因此，本研究考虑可被HBT封闭住的24例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性者结果为嗜异性抗体干扰导致的假阳性可能性大，而没有被HBT封闭住的1例SARS-CoV-2 IgM抗体阳性患者及5例SARS-CoV-2 IgG抗体阳性患者可能还存在其他潜在未明确的干扰因素，造成假阳性结果，需要进一步研究。这为临床医生提供了对SARS-CoV-2抗体阳性结果分析解读的经验，建议临床医生一定要结合受检者的流行病学调查、临床表现、实验室数据及影像学资料等综合进行分析及诊断。同时应考虑到实验室的各种指标是在COVID-19患者感染后的不同阶段才能出现变化，还应知晓实验结果会受到许多因素的干扰。

嗜异性抗体可以与试剂中的免疫球蛋白结合，干扰体外免疫检测，与胶体金试剂相比，化学发光法试剂中含有消除干扰的抑制剂，使假阳性样本的存在可能性减小。因COVID-19疫情早期，胶体金法检测SARSCoV-2抗体首先获国家药品监督管理局批准用于临床；化学发光法检测SARS-CoV-2抗体是后续被批准用于临床，且还需要配套的仪器。本研究SARS-CoV-2抗体阳性样本采用不同厂家胶体金试剂进行复检，并同时进行核酸检测。本研究再将30例胶体金法检测阳性标本采用化学发光法进行复检后，结果提示只有3例抗体阳性，抗体假阳性率明显减低，这提示胶体金法检测新冠抗体受嗜异性抗体干扰大于化学发光法。

干扰免疫学方法检测系统导致假阳性结果的内源性干扰物质较多，最常见于类风湿因子、补体、免疫球蛋白、自身抗体等，通过非特异结合干扰检测过程。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》［13］提到体内存在干扰物质如类风湿因子、嗜异性抗体、补体、溶菌酶等，抗体检测可能出现假阳性。本研究数据发现30例SARS-CoV-2抗体假阳性受检者的类风湿因子、补体、免疫球蛋白水平基本均在参考范围内。因此本研究推测类风湿因子、补体、免疫球蛋白不是引起SARS-CoV-2抗体检测假阳性的首要原因。

由于存在可能导致SARS-CoV-2抗体检测假阳性的情形，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》［13］强调抗体检测的前提条件是，临床怀疑COVID-19且核酸检测阴性的患者及病情处于恢复期且核酸检测阴性的患者可通过抗体检测进行诊断。国家药品监督管理局批准的SARS-CoV-2抗体检测试剂说明书中也指出抗体检测仅用作对SARS-CoV-2核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用，不能作为COVID-19确诊和排除的依据，不适用于一般人群的筛查。一般不单独以血清学检测作为诊断依据，需结合流行病学史、临床表现和基础疾病等情况进行综合判断。血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体联合检测是SARS-CoV-2核酸检测假阴性的有效互补［14］。抗体的产生有一定的时期，抗体检测结果还可帮助识别COVID-19患者的感染阶段［15］。我院确诊1例非典型症状的轻型COVID-19患者，有高风险小区密切接触史，临床表现有鼻塞、流涕、咳嗽，有黄痰，无发热。其出现症状1 d后采样发现SARS-CoV-2核酸阳性，而同时查IgM和IgG抗体均为阴性。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》［13］提到“SARS-CoV-2特异性IgM抗体、IgG抗体在发病1周内阳性率较低”，因此考虑该患者可能是处于早期感染，尚未产生抗体，而不是抗体检测假阴性。后续动态监测该患者抗体，2周时IgM结果为弱阳性，IgG抗体阴性，1个月时检测抗体均为阴性。

本研究通过探究SARS-CoV-2抗体检测结果的干扰因素，发现嗜异性抗体可能是导致胶体金法检测SARSCoV-2抗体IgM假阳性的主要原因，在临床实践中，特别是非COVID-19疫情流行区域，当遇到SARS-CoV-2抗体阳性的情况，除了可以动态监测抗体结果的变化及动态观察患者的临床情况，还可以采用HBT对SARSCoV-2抗体阳性的标本进行处理，从而减少SARSCoV-2抗体假阳性报告率。而SARS-CoV-2抗体IgG假阳性原因需要进一步研究。临床在分析解读SARSCoV-2抗体检测阳性结果时，一定要考虑实验的干扰因素，非疑似COVID-19患者或确诊COVID-19患者不宜进行SARS-CoV-2抗体检测指导临床。

作者贡献：戴菊华进行课题的构思与设计，文献查询，撰写论文；林博之进行数据收集、整理；戴菊华、孙新平负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。