补中益气汤对荷MFC胃癌小鼠骨骼肌ATP生成、线粒体氧耗量及ATP合成酶表达的影响

★ 张雨璇 胡金鸿 陈谦峰（江西中医药大学 南昌 330004）

胃癌作为消化系统中患病第一的癌症,其病死率也位居前列［1］。近年来，胃癌的发病率居高不下，且出现年轻化趋势。目前来说，手术切除是治疗胃癌最主要的手段，且随着腹腔镜技术和内镜治疗技术的不断发展和完善，胃癌的治愈率也得到一定程度的提高。但是它们的适用人群主要是胃癌早期患者，所以对于侵袭部位深、有远处转移、以及中晚期胃癌患者来说，目前主要还是依靠化学治疗。癌因性疲乏（cancer-related fatigue，CRF）是肿瘤及其治疗过程中最常见的并发症之一，有研究表明大部分采取化疗、放疗的肿瘤患者，晚期均有过疲劳感［2］。CRF临床表现主要为:非特异性疲劳、焦虑、悲伤感、睡眠障碍、情绪低落等症状，对患者的生活产生了负面影响。胃癌相关性疲劳是CRF中较为常见的一种，它与一般的疲劳不同在于，它的治疗要立足于其肿瘤疾病本身。众多研究表明有氧糖酵解是肿瘤代谢的主要方式，通过益气健脾来提高细胞线粒体的氧化磷酸化，与癌细胞抢夺能源，抑制癌细胞进行有氧糖酵解代谢，进而起到让癌细胞凋亡的目的［3］。因此，胃癌相关性疲劳与线粒体的氧化磷酸化密切相关，故提高患者的氧化磷酸化显得至关重要。

补中益气汤为脾胃派的经典方，具有健脾益气之功用，主治脾气虚损之证。因营卫气血的化生有赖于脾胃的运化，若脾胃气虚，则会少气乏力、面黄纳呆、懒言倦怠；脾在志为思，脾虚气弱则思虑不决。中医有研究表明，脾的功能与线粒体能量代谢有密切关系，而且补中益气汤对线粒氧化磷酸化过程有一定的保护作用［4］。此外，一项小样本量的临床观察发现“补中益气丸对CRF有效”［5］。但尚未有关于补中益气汤对胃癌CRF的影响及作用机制的研究。本文拟通过观察补中益气汤对荷MFC胃癌细胞模型动物的骨骼肌ATP、ADP、AMP含量，及线粒体膜电位JC-1单体/聚合物、ATP合成酶蛋白的影响，研究补中益气汤抗胃癌相关性疲劳的机制。

1 材料

1.1 药物 补中益气汤购自江西省中医院中药房（黄芪15 g、党参15 g、白术10 g、当归10 g、陈皮6 g、柴胡12 g、升麻 6 g、炙甘草15 g、生姜 9 g、大枣18 g）；制备采取常用中药煎剂方法，首先纯净水洗净，至少两遍，并浸泡30 min，初次煎煮1 h，过滤，得到上层澄清滤液；再加水煎煮1 h左右，过滤，将两次滤液混合浓缩得到所需浓度溶液，4 ℃分装保存，用时水浴加热至常温。本实验所需补中益气汤浓度分为高、中、低三种，根据人和动物之间的剂量换算，可得低浓度为0.437 5 g/mL、中浓度为0.875 g/mL、高浓度为1.75 g/mL。注射用环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX），江西恒瑞医药股份有限公司，批号H32020857）。

1.2 动物和瘤株 小鼠：60只SPF级KM雄性小鼠，体重（20±2）g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（苏）2016-0010。小鼠胃癌MFC细胞来源：由中科院细胞库提供（编号CBP60882）。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准，批准号：JZLLSC2018-0061。

1.3 试剂 ATP、ADP、AMP标准品（美国Sigma公司，货号分别为A2383、A2754、A1752）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号AR0146）；组织线粒体分离试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为C3606，C2006）；RIPA裂解液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号B1828）；PVDF转印膜、ECL化学发光试剂盒（Millipore公司，货号分别为IPVH00010、WBKLS0100）；X光胶片（美国柯达公司，货号6535876）。

1.4 仪器 高效液相色谱仪（美国Waters公司）；色谱柱（美国phenomenex公司）；TDK-2水平脱色摇床（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；S-1-150S台式高速冷冻离心机（巩义市宏华仪器设备工贸有限公司）；智能型电泳仪（南京普阳科学仪器研究所），垂直电泳槽（美国赛默飞公司）；DYCZ-40D型迷你转印电泳槽（北京六一仪器厂）；NovoCyte型流式细胞仪（美国ACEA公司）。

2 方法

2.1 小鼠MFC胃癌细胞培养及传代方法 将腹水型小鼠胃癌MFC细胞，置5 % CO2、37 ℃培养箱中，用含10 % FCS的RPMI 1640完全培养基悬浮培养。选取活力最优的小鼠MFC胃癌细胞，调整浓度为5×106/mL，以0.2 mL/只无菌注入KM小鼠腹腔，进行体内传代，待小鼠腹部隆起并有腹水，便可用于小鼠皮下移植瘤的接种［6］。

2.2 小鼠荷MFC胃癌模型制作方法 将接种胃癌MFC瘤种7~9 d的小鼠脱颈处死，在无菌环境下抽取瘤液腹水，经生理盐水稀释、1500转离心5分钟后，调整MFC细胞浓度为5×106/ml，在小鼠右侧腋部皮下注射，接种量为1×106个细胞/只（2 mL）。接种后第三天可在小鼠右腋下接种处触及肿瘤硬块，成瘤率100 %。

2.3 分组与给药 将小鼠随机分成5组，分别为模型组，补中益气汤高剂量组、中剂量组、低剂量组，阳性对照组，每组12只。接种24 h后，补中益气汤低剂量组（0.045 g·kg-1·d-1）、中剂量组（0.09 g·kg-1·d-1）、高剂量组（0.18 g·kg-1·d-1）灌胃给药，每只0.5 mL，每日2次；阳性对照组使用环磷酰胺（0.05 g·kg-1·d-1）隔日腹腔注射；模型组给传代肿瘤小鼠予等体积生理盐水灌胃。连续给药2周，治疗结束，处死各组小鼠。

2.4 HPLC检测骨骼肌ATP、ADP及AMP含量色谱条件为流动相30 mM NaH2PO4（pH=6.25），3 % 甲醇；检测波长254 nm，进样量20 μL，柱温为室温，样品温度4 ℃。配置不同浓度的ATP、ADP、AMP溶液，测定后以峰面积为Y轴，浓度为X轴进行线性拟合，得到的标准曲线。组织称重、粉碎、匀浆；10 000×g 4℃离心10 min，取上清液100 μL，加入1 mol/L 碳酸钾-甲醇混合液（体积比4∶1）中和高氯酸50 μL，10 000×g 4℃离心10 min，取上清100 μL加水100 μL稀释，HPLC检测。

2.5 检测骨骼肌线粒体的膜电位JC-1单体/聚合物 剖取各组小鼠的骨骼肌冰上保存，使用组织线粒体分离试剂盒进行线粒体分离，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行样品蛋白浓度测算，使用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）结合流式细胞仪分析单体/聚合物数值（其中JC-1单体激发波长为490 nm，发射波长为530 nm；JC-1聚合物激发波长为525 nm，发射波长为590 nm）。

2.6 Western blot检测ATP合成酶蛋白的表达 取小鼠骨骼肌（腓肠肌）组织，进行蛋白免疫印迹（western blot）检测。依次配置溶液、制备样品、SDS-PAGE凝胶电泳、化学发光、显影、定影后，通过蛋白质印迹检测图像分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白ATP6V1G2/tubulin灰度值反映ATP合成酶蛋白表达水平。

2.7 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计处理，各组实验数据以（）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以（P＜0.05）表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 补中益气汤对荷MFC小鼠骨骼肌ATP、ADP、AMP含量的影响 与模型组比较，中剂量组的ATP及ADP含量显著升高（P＜0.01），阳性对照组、高剂量组、低剂量组的ATP及ADP含量升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，中剂量组的ATP及ADP含量显著升高（P＜0.01）,高剂量组、低剂量组的ATP及ADP含量升高（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组、低剂量组的ATP及ADP含量降低（P＜0.05）。

与模型组比较，中剂量组的AMP含量显著降低（P＜0.01），阳性对照组、高剂量组、低剂量组的ATP及ADP含量降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，中剂量组的AMP含量显著降低（P＜0.01）,高剂量组、低剂量组的ATP及ADP含量降低（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组、低剂量组的AMP含量升高（P＜0.05）。见表1。

表1 补中益气汤对荷MFC小鼠骨骼肌ATP、ADP、AMP含量的影响（，ng/mg）

表1 补中益气汤对荷MFC小鼠骨骼肌ATP、ADP、AMP含量的影响（，ng/mg）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 n ATP ADP AMP模型组 9 601.393±58.411 271.457±41.182 157.080±14.684阳性对照组 10 651.973±52.945* 285.680±78.669* 147.003±18.016*中剂量组 10 906.183±83.386**## 356.013±43.533**## 127.407±7.899**##高剂量组 10 878.507±75.288*#▲ 312.467±52.717*#▲ 136.387±21.654*#▲低剂量组 10 735.523±68.344*#▲ 291.793±45.766*#▲ 146.747±4.686*#▲

3.2 补中益气汤对荷MFC胃癌小鼠骨骼肌线粒体膜电位JC-1单体/聚合物的影响 线粒体膜电位JC-1单体/聚合物%的比值越小，说明线粒体膜电位越大。与模型组比较，阳性对照组、中剂量组、高剂量组、低剂量组的单体/聚合物%显著降低（P＜0.01）；与阳性对照组比较，中剂量组的单体/聚合物%显著降低（P＜0.01）,高剂量组、低剂量组的单体/聚合物%降低（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组、低剂量组的单体/聚合物%升高（P＜0.05）。见表2。

表2 补中益气汤对荷MFC胃癌小鼠骨骼肌线粒体膜电位JC-1单体/聚合物的影响（，%）

表2 补中益气汤对荷MFC胃癌小鼠骨骼肌线粒体膜电位JC-1单体/聚合物的影响（，%）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 n JC-1单体 JC-1聚合物 JC-1单体/聚合物模型组 9 4.223±0.412 93.162±9.391 4.743±0.401阳性对照组 10 2.302±0.243 95.563±8.972 2.407±0.262**中剂量组 10 0.415±0.043 99.240±10.181 0.413±0.038**##高剂量组 10 1.513±0.061 98.852±9.673 1.516±0.061**#▲低剂量组 10 1.580±0.032 98.641±8.950 1.588±0.020**#▲

3.3 补中益气汤对荷MFC胃癌小鼠骨骼肌线粒体ATP合成酶表达的影响 与模型组比较，中剂量组的ATP合成酶蛋白表达显著升高（P＜0.01），阳性对照组、高剂量组、低剂量组的ATP合成酶蛋白表达升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，中剂量组的ATP合成酶蛋白表达显著升高（P＜0.01）,高剂量组、低剂量组的ATP合成酶蛋白表达升高（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组、低剂量组的ATP合成酶蛋白表达降低（P＜0.05）。

表3 补中益气汤对荷MFC胃癌小鼠骨骼肌线粒体ATP合成酶表达的影响（，OD）

表3 补中益气汤对荷MFC胃癌小鼠骨骼肌线粒体ATP合成酶表达的影响（，OD）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 n ATP6V1G2 tubulin ATP6V1G2/tubulin模型组 9 4.609±0.038 10.502±0.121 0.439±0.056阳性对照组 10 5.644±0.076 11.542±0.136 0.516±0.059*中剂量组 10 9.701±0.084 10.694±0.125 0.946±0.089**##高剂量组 10 7.151±0.093 9.845±0.102 0.722±0.093*#▲低剂量组 10 5.866±0.078 10.625±0.118 0.563±0.075*#▲

4 讨论

胃癌是我国常见的消化系统癌症，其并发症——胃癌相关性疲劳，是影响患者的生活质量的重要原因之一。有研究总结脾胃亏损是胃癌所有病机共同拥有的主线［7］。补中益气汤是“脾胃学说”创始人李杲的代表方，主治脾虚气陷，气虚发热。据文献和研究表明，有氧糖酵解是肿瘤代谢的主要方式。由能量驱动的骨骼肌运动是机体活动的主要方面，体内ATP是能量物质的主要存在形式，而ATP主要是在机体的“能量加工厂”——线粒体的氧化磷酸化生成。作为必不可少的催化剂——ATP合成酶，是细胞膜上的一种蛋白酶，机体在缺氧及疲劳等状态下，ATP合成酶受到损伤，活力下降［8］。因此，ATP、ADP和AMP的含量与胃癌CRF密切相关，骨骼肌中线粒体含量和ATP合成酶表达均能反映机体是否疲劳及疲乏程度。目前提出的CRF病因机制假说中“肌肉的改变和ATP代谢异常”较为大家认可［9］。

本文在对骨骼肌ATP生成的影响实验和骨骼肌线粒体氧耗量影响实验表明，补中益气汤中剂量组的ATP、ADP含量明显增加，线粒体膜电位没有很大的变动、ATP储存量良好、耗氧量无明显减少。线粒体的膜电位可以体现它的功能，若线粒体膜电位稳定则说明细胞状态良好，而线粒体膜电位下降是细胞凋亡的早期现象，导致ATP生成不足，则线粒体耗氧量下降。胃癌相关性疲劳会导致线粒体形态改变、ATP代谢异常、细胞内ATP匮乏以及ATP数量减少的症状，会导致线粒体耗氧量下降。补中益气汤可通过“健脾”对骨骼肌线粒体氧化磷酸化过程有一定的保护作用，并通过保护骨骼肌的氧化磷酸化使得胃癌CRF得以缓解。补中益气汤保护骨骼肌的氧化磷酸化作用机理是使ADP和AMP可以更高效率转化为ATP，减少氧化磷酸化过程，为机体代谢和生命活动的维持，提供更好的条件，以降低疲劳感。

补中益气汤对线粒体ATP合成酶表达影响的实验结果分析可知：补中益气汤能够有效地促进线粒体ATP合成酶的活性，从而增强小鼠的活动性，达到治疗肿瘤相关性疲劳的作用。正常情况下，电子传递链和磷酸化紧密结合，当有其他物质干扰磷酸化反应时则氧化磷酸化不能正常进行，癌细胞与小鼠机体正常细胞争夺能量，导致氧化磷酸化不能正常进行，即出现胃癌疲劳。补中益气汤能够有效的抑制癌细胞，增强机体细胞夺取能量的能力，从而达到缓解CRF的效果。这表明补中益气汤可通过“益气”对骨骼肌线粒体能量储备有一定的促进作用，有增强机体机能、恢复机体体力、改善疲劳状态、固元培本的效能。

本文研究补中益气汤抗胃癌相关性疲劳的机制，引入现代生命科学研究成果，特色地将“健脾”与“保护骨骼肌氧化磷酸化”相联系，“益气”与“增强线粒体能量储备”相联系，赋予补中益气汤“健脾”及“益气”功效以具体指向，极富中西医结合特色。中医补中益气汤“健脾益气”治法理论指导治疗癌性疲劳研究，揭示该方抗胃癌CRF“健脾益气”治法的科学内涵，既有中医理论指导，又有现代研究内容，拓展了CRF治疗新思路。