电针对透镜诱导型近视豚鼠脉络膜血流和内皮素-1及其受体表达的影响

於 亭，魏慧霞，田庆梅，纪海峰，宋继科,3,4，解孝锋

0引言

目前我国已成为世界第一近视大国，并且近视已成为世界范围内的主要公共卫生问题。Holden等[1]预测，到2050年，将有47.58亿近视患者(占世界人口的49.8%)和9.38亿高度近视患者(占世界人口的9.8%)。目前造成近视的原因尚不明确[2]，对近视的治疗仍以矫正视力的方法为主，但现有的治疗方法尚不能解决近视增长率逐年增加的问题[3]。近视的发生发展主要与眼轴过度增长相关，其中脉络膜作为视网膜和巩膜之间的高度血管化层，其独特位置可将视网膜信号传递至巩膜，在近视的发展中起重要作用[4]。动物实验[5]及临床研究[6-7]也已证实脉络膜与近视的发生发展密切相关。近来在近视研究中发现，与正常对照相比，在眼轴大于26mm的高度近视患者中内皮素-1(endothelin-1，ET-1)的血清浓度发生改变，提示ET-1可能参与近视发展，但其机制尚未完全明确[8]。而脉络膜作为眼内高度血管化组织可能受到血管收缩因子ET-1的影响参与近视发生发展。针刺疏通经络、调畅气血，使经脉之气血旺盛通达[9]。大量临床实践证实，针刺治疗近视相比其他治疗方案显示出更加显著效果[10-14]，但目前针刺治疗近视，仍多停留在临床研究水平，且其效应机制不清楚。本研究拟建立透镜诱导型近视豚鼠模型，探讨近视发展过程中豚鼠脉络膜毛细血管血流密度和脉络膜ET-1及其受体表达变化，并通过电针干预治疗初步阐释其对近视的治疗作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物选用雄性健康英国种三色短毛豚鼠(济南西岭角生物科技有限公司)，体质量100～120g，实验动物入组前均排除白内障、角膜病变、近视等眼病。饲养条件：室温保持22℃～25℃，予以12h/12h的昼夜节律，环境光照300Lx。实验期间所有豚鼠自由摄食、进水，并给予富含维生素的饲料及新鲜蔬菜等以补充维生素C。实验中严格遵守视觉与眼科动物研究协会原则，并且经山东中医药大学动物伦理委员会审核批准。

1.1.2主要仪器及试剂10g/L盐酸环喷脱酯滴眼液(爱尔康中国眼科产品有限公司，北京)；4g/L盐酸奥布卡因(日本参天制药株式会社，日本)；组织/细胞RNA快速提取试剂盒、反转录试剂盒(含基因组去除剂)、化学修饰热启动实时荧光定量PCR试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(思科捷科学仪器有限公司，山东)；ET-1、ETAR、ETBR试剂盒(江莱生物科技有限公司，上海)；ET-1一抗(博奥森生物技术有限公司，北京)；ET-1二抗(思科捷科学仪器有限公司，山东)；荧光倒置显微镜(Leica DM IL LED)；带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)；眼科超声诊断仪(Quantel Medical Ophthalmology公司，法国)；光学相干断层扫描仪(SpectralisHRA+OCT，海德堡公司，德国)；Elx800 酶标仪(BioTek，美国)；针灸针(华佗牌苏州医疗用品厂有限公司)，电子诊疗仪(华佗牌SDZ-V型，苏州医疗用品厂有限公司)。

1.2方法

1.2.1造模及分组45只豚鼠，随机均分为正常对照(normal control，NC)组、透镜诱导(lens-induced myopia，LIM)组、电针+透镜诱导(lens-induced myopia+electroacupuncture，LIM+EA)组，每组15只。NC组豚鼠正常饲养，不干预；LIM组豚鼠使用医用胶带将-6.00D透镜片配戴于豚鼠右眼，以建立近视模型，左眼不干预，见图1；LIM+EA组在右眼透镜诱导近视，左眼不干预，同时给予双侧合谷穴和太阳穴针刺，每天固定于上午9∶00开始电针治疗，干预30min，早、晚巡视，及时发现脱落及脏的镜片，清洗干净后及时戴上，左眼为自身对照不干预。电针参数：连续波，频率2Hz，强度2mA，脉冲长度0.1s。

1.2.2检影验光各组豚鼠于2、4wk行带状检影验光检查。检查前结膜囊内用10g/L盐酸环喷脱酯滴眼液滴眼3次，每次1滴，间隔10min，滴眼后30min由同一验光师在暗室中进行检影验光，屈光度为垂直和水平两条主子午线检验的平均值。

1.2.3A超检测眼轴长度由眼科A超测量，检查前以4g/L盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉。眼科超声诊断仪参数设置：前房传播速度1557m/s，玻璃体传播速度1540m/s，晶状体传播速度1723m/s。测量时探头垂直角膜平面，且尽可能对准瞳孔中心，不压迫角膜，取图形较稳定、清晰且晶状体后囊膜和视网膜双峰均高于基线为确定图像，每眼重复测量10次，取平均值。整个过程均由同一技师操作完成。

1.2.4OCTA检查各组豚鼠于2、4wk行OCTA检查。检查前结膜囊内用10g/L盐酸环喷脱酯滴眼液滴眼3次，每次1滴，间隔10min，滴眼后30min进行检测。由一人将豚鼠固定于OCT颌架合适位置，另一人按照设备使用方法对豚鼠眼球后极部进行扫描。选择870nm波长，以视盘中心为中心，选择1.5mm×3mm大小进行拍摄。脉络膜毛细血管定义为Bruch膜至膜下20μm，选取图像质量大于30的图像，使用Image J 1.8.0软件进行测量。首先截取图片，然后将图片二值化(图2B)，分析血流面积(图2中白色高亮部分)与全部面积的比值。每只豚鼠测量3次，取平均值。测量过程均由两位医师在OCT检查室内进行操作完成。

图2 OCTA图像 A：以视盘为中心，选择1.5mm×3mm大小进行检测；B：脉络膜毛细血管层血管造影图像。

1.2.5q-PCR 造模2、4wk后每组随机选取3只豚鼠，麻醉致死后取出右眼眼球，沿角巩膜缘剪开，去除角膜、虹膜、晶状体等眼前节组织，剥离玻璃体，使用虹膜刮去除视网膜，获取脉络膜组织。提取总RNA，逆转录为cDNA，采用q-PCR技术检测ET-1、ETAR和ETBR mRNA表达水平，以GAPDH为内参基因。利用DNAStar 7.0软件设计引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。采用2-△△Ct方法对结果进行分析，将NC组目的基因的相对表达量设置为1。

表1 ET-1、ETAR和ETBR引物序列

1.2.6ELISA检测造模后2、4wk，每组取3只豚鼠，麻醉致死后分离右眼脉络膜组织。使用液氮研磨，按质量体积比(20mg∶200μL)加入含苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF)的放射免疫沉淀法缓冲液裂解液(radio immunoprecipitation assay buffer,RIPA)，充分匀浆直至裂解完全，14000r/min离心4min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。按照酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒步骤检测ET-1、ETAR和ETBR蛋白表达水平。

1.2.7免疫组化检测造模4wk后，每组取3只豚鼠，麻醉致死后在12∶00方向用墨水做标记，分离右眼球，剔除多余组织，置于眼球固定液中固定24h后进行石蜡包埋。于视神经前0.5mm处进行5μm切片,梯度乙醇水化,超纯水浸泡5min，水浴锅加柠檬酸钠抗原修复液(95℃ 15min)进行抗原修复，PBS清洗。正常山羊血清封闭，依次加入一抗(1∶100)、二抗(1∶200)进行孵育，DAB显色(1min 22s)，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。显微镜下观察、拍照。以细胞质内出现淡黄色或深棕色颗粒沉积者为染色阳性反应。各组豚鼠随机选取5张切片,每张切片在20倍镜下随机采集视野。

2结果

2.1屈光度和眼轴各组右眼屈光度在不同时间点比较，差异有统计学意义(F时间=1230.509，P时间<0.001；F组间=737.843，P组间<0.001；F组间×时间=222.284，P组间×时间<0.001)。造模后2、4wk，与NC组右眼相比，LIM组、LIM+EA组右眼近视屈光度均增加(均P<0.001)。造模后2、4wk，与LIM组右眼相比，LIM+EA组右眼近视屈光度减小(均P<0.01)，见表2。

表2 造模2、4wk后豚鼠屈光度和眼轴比较

各组右眼眼轴在不同时间点比较，差异有统计学意义(F时间=1463.554，P时间<0.001；F组间=52.529，P组间<0.001；F组间×时间=15.150，P组间×时间<0.001)。造模后2、4wk，与NC组右眼相比，LIM组、LIM+EA组右眼眼轴均增加(均P<0.001)。

造模后2、4wk，与LIM组右眼相比，LIM+EA组右眼眼轴均减小(P<0.05，<0.01)，见表2。

2.2脉络膜毛细血管密度OCTA结果表明，造模2、4wk后，各组脉络膜毛细血管密度比较，差异均有统计学意义(2wk：F=5.645，P<0.05；4wk：F=16.563，P<0.001)。造模2、4wk后，与NC组(2wk：28.74%±4.11%，4wk：27.64%±2.91%)相比，LIM组右眼脉络膜毛细血管密度降低(2wk：23.43%±3.9%，P<0.01；4wk：21.29%±2.17%，P<0.001)。造模2、4wk后，与LIM组相比，LIM+EA组右眼脉络膜毛细血管密度升高(2wk：27.66%±1.43%，P<0.05；4wk：25.28%±2.39%，均P<0.01)。造模2、4wk后，与NC组相比，LIM+EA组差异均无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 造模2、4wk时脉络膜毛细血管密度 aP<0.05，bP<0.01 vs LIM组。

2.3ET-1和ETAR及ETBRmRNA表达水平PCR结果表明，不同时间点各组右眼脉络膜中ET-1、ETAR、ETBR mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义(2wk：FET-1=15.086，PET-1<0.01；FETAR=7.331，PETAR<0.05；FETBR=9.368，PETBR<0.05；4wk：FET-1=17.844，PET-1<0.01；FETAR=37.084，PETAR<0.001；FETBR=20.153，PETBR<0.05)。造模2、4wk后，与NC组相比，LIM组ET-1、ETAR、ETBR mRNA表达水平升高(均P<0.05)；与LIM组相比，LIM+EA组ET-1、ETAR、ETBR mRNA表达水平降低(2wk：ETAR，P>0.05；其余均为P<0.05)；与NC组相比，LIM+EA组ET-1、ETAR、ETBR mRNA表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图4 造模2、4wk时ET-1、ETAR、ETBR mRNA表达水平 aP<0.05，bP<0.01 vs LIM组。

2.4ET-1和ETAR及ETBR蛋白表达水平ELISA结果表明，不同时间点各组右眼脉络膜中ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(2wk：FET-1=15.464，PET-1<0.01；FETAR=6.098，PETAR<0.05；FETBR=15.988，PETBR<0.01；4wk：FET-1=25.829，PET-1<0.01；FETAR=49.759，PETAR<0.001；FETBR=12.391，PETBR<0.01)。造模后2、4wk，与NC组相比，LIM组右眼脉络膜中ET-1、ETAR、ETBR蛋白表达水平升高(均P<0.05)；与LIM组相比，LIM+EA组ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表达水平降低(2wk：ETAR，P>0.05；其余均为P<0.05)；与NC组相比，LIM+EA组ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 造模2、4wk后脉络膜ET-1、ETAR、ETBR蛋白表达水平

2.5免疫组化检测脉络膜ET-1蛋白造模后4wk可见，ET-1免疫阳性反应呈棕色,脉络膜胞质内表达。NC组中脉络膜ET-1免疫反应呈棕色，且血管排列整齐有序；LIM组中脉络膜ET-1免疫反应较强，着色较深，且血管排列紊乱不齐；LIM+EA组中脉络膜ET-1免疫反应呈棕色，且血管排列相对整齐，见图5。

图5 造模后4wk时ET-1蛋白在脉络膜中的表达 A：NC组；B：LIM组；C：LIM+EA组。

3讨论

豚鼠属于哺乳动物，由于其屈光状态、正视化机制与人类相似，常用于制作近视模型[10-11]，并且豚鼠透镜诱导型模型已广泛应用于近视的实验研究。本实验采用负透镜诱导豚鼠制备近视模型，研究模拟人眼在近距离工作状态下近视发生发展中的作用，为本研究奠定了模型基础。

ET-1是于1988年首次从猪主动脉内皮细胞的培养上清液中分离出来一种有效的血管收缩剂[15]，是评估眼内血动力的有用标志，在角膜上皮、睫状体、脉络膜以及视网膜血管内皮细胞中均有表达[16]。近来，有研究报道发现ET-1含量在高度近视儿童和青少年血清中含量发生改变[8]。与眼轴小于26mm的近视患者相比，在眼轴大于26mm的患者中发现ET-1血清浓度显著降低，并且ET-1浓度与眼轴长度呈弱负相关，提示ET-1的水平变化可能影响近视发展[8]。ET-1属于内源性血管收缩因子，是评估眼内血流动力学的有用标志物，并且ET-1在眼内分布广泛，脉络膜中水平最高[17]。ET-1主要通过与ETAR和ETBR结合而发挥血管收缩作用[8]。研究发现ET-1可以通过调节眼收缩，以调节视网膜血流[8]。而豚鼠作为无视网膜血管哺乳动物[18]，其血液以及氧气供应的主要来源是脉络膜[4]。研究已发现，向健康男性注射ET-1后会降低脉络膜的血流[19]。并且越来越多的证据也表明近视发展过程中脉络膜血流会降低[6,20-21]。提示ET-1可能会通过影响脉络膜血流参与近视的发生发展。而在本研究中我们发现，在近视发展过程中，随着脉络膜毛细血管密度降低，血流下降的同时ET-1表达水平明显上调，符合我们的猜测。

在解剖学上，脉络膜是由毛细血管和中大血管组成，其中血管是不断暴露于脉动血流和压力引起的各种类型的血动力中，而作为与血液直接接触的单层，血管内皮细胞承受着大部分流体剪切应力[22]。剪切力可以通过刺激血管扩张剂的产生对血管内皮产生保护作用[23]，并且研究发现剪切力的变化会改变ET-1的表达[24]。先前已有研究报道，脉络膜毛细血管的血流与近视程度负相关[25]。此外，Zhang等[5]在近视豚鼠中发现，随着近视程度的加深脉络膜血流逐渐降低，而Gupta等[20]在人类高度近视眼中也发现脉络膜血管成分的减少。Al-Sheikh等[6]研究发现与正常组相比，在近视眼中脉络膜毛细血管血流面积显著降低。Milani等[26]在高度近视患者中也发现，脉络膜毛细血管灌注区减少，脉络膜毛细血管密度降低。提示脉络膜毛细血管密度与近视密切相关。本实验也证实在近视发展中脉络膜毛细血管密度降低。而脉络膜血流的减少会影响血管剪切力，这可能会影响ET-1的表达。在本研究中发现，随着近视的发生发展脉络膜变薄，ET-1及其受体表达水平明显上调，可能是ET-1通过与ETAR和ETBR结合引起了脉络膜血管的收缩，导致脉络膜血流降低影响近视的发展。

目前对于近视的治疗手段十分有限，而针刺在临床[12-13]和动物[10-11]中已证实可以改善近视发展，但具体机制尚未明确。有研究发现针刺后可以降低眼周血管平滑肌紧张度，解除睫状肌痉挛，加快血流速度，改善消除缺血和缺氧状态，而有利于眼缓解视疲劳症状[12]。因此，我们猜测电针可以改善脉络膜血液循环。

脉络膜主要是处于交感神经和副交感神经调控之下[27]。目前研究发现哺乳动物和鸟类的脉络膜主要分布三种神经纤维：(1)来自翼腭神经节(pterygopalatine ganglion，PPG)和睫状神经节产生的副交感神经纤维；(2)来自颈上神经节产生的交感神经纤维；(3)来自三叉神经节的感觉纤维。其中哺乳动物中的PPG是从面部核运动复合物的唾液上核(superior salivatory nucleus,SSN)接收输入的[28]。Linder[29]在出血性低血压兔子中发现，面部神经刺激可使脉络膜血流升高。先前的研究也表明，下丘脑支核的血液压力敏感位点可输入到SSN的脉络膜神经元，由SSN-PPG通路介导部分对脉络膜血管舒张性补偿[27]。此外，有研究发现电针刺激大鼠脉络膜血管的副交感神经节前纤维细胞体的SSN,可使眼底血流增加[30]。提示，电针可通过SSN-PPG通路提高近视发展中的脉络膜血流。因此，我们猜测电针干预治疗后，通过SSN-PPG通路改善了脉络膜的血流，影响了血管剪切力下调ET-1及其受体含量，延缓近视的发生发展。本研究中，我们也观察到电针干预后脉络膜毛细血管血流密度上升，改善了脉络膜血流，下调ET-1及其受体含量。然而，具体信号分子及发展机制尚未完全明确，仍需进一步研究。其中，脉络膜血流将是我们今后研究的重点，不断探索电针治疗近视与脉络膜血流变化之间的内在相关性，为近视的治疗提供有效的分子生物学基础。