TRPV1在胃食管反流病患者发病中的作用机制

许智超，年媛媛，孟宪梅

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指各种原因使胃、十二指肠内容物向上反流入食管引起反酸和(或)胸骨后烧灼感(即烧心)症状[1]，根据内镜下表现，GERD可分为反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)、非糜烂性反流病(non erosive reflux disease，NERD)、Barrett′s食管(Barrett′s esophagitis，BE)[2]。GERD的三种亚型在发病机制上存在一定差异，其症状的严重程度与内镜下食管黏膜受损程度并不完全一致，有研究表明，这与瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)和内脏高敏感(visceral hypersensitivity，VH)有关。

VH的发生机制尚不明确，可能是由于TRPV1上调引起，TRPV1是一种非选择性阳离子通道，广泛分布于胃肠道黏膜层、黏膜下层和肌层，参与胃肠动力、分泌和内脏感觉，对食管敏感性和黏膜炎症有重要的调节作用，但其在GERD中的研究报道较少，与VH的具体作用尚不明确[3]。

本研究采用免疫组化、Western-blot、RT-PCR等技术检测GERD各亚型患者食管黏膜TRPV1蛋白和mRNA的表达情况，进而了解TRPV1在GERD患者发病中的作用机制，为GERD的治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 患者资料

选择2019年1—12月就诊于内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院消化病研究所胃镜室的患者，采用胃食管反流病问卷(gastroesophageal reflux disease questionnaire，GerdQ)初步入组GERD患者和正常对照组患者，根据临床症状和内镜下食管黏膜表现将入组患者分为RE组、NERD组、正常对照组，收集其食管黏膜标本共114例，年龄18～70岁，平均年龄为(42.52±9.10)岁，其中RE组57例，男29例，女28例，平均年龄为(41.95±10.32)岁；NERD组28例，男14例，女14例，平均年龄为(42.50±7.70)岁；正常对照组29例，男15例，女14例，平均年龄为(43.66±7.88)岁。免疫组化共入组54例，RE组37例，NERD组8例，正常对照组9例；Western-blot共入组30例，三组患者各10例；RT-PCR共入组30例，三组患者各10例。各组别患者性别、年龄均无统计学差异。因为临床上RE患者和NERD患者较多见，所以我们只研究TRPV1在GERD的这两种亚型与正常对照的表达差异。

1.2 入组标准与排除标准

所有入组对象检查前停用质子泵抑制剂≥7 d，停用 H2受体拮抗剂≥3 d，停用促动力药≥48 h，停用抗酸剂≥6 h[4]。均接受内镜检查，通过医院伦理委员会批准并签写内镜检查及活检知情同意书。

RE入组标准：具有典型反酸、烧心症状且一周出现3次以上，病程大于3个月，GerdQ≥8分，内镜下有食管黏膜破损表现且RE分级≥B级；

NERD入组标准：具有典型反酸、烧心症状且一周出现3次以上，病程大于3个月，GerdQ≥8分，内镜下无食管黏膜破损表现；

正常对照入组标准：GerdQ<8分，既无反流症状也无内镜下食管黏膜破损表现。

排除标准：①内镜下有食管裂孔疝、食管肿瘤及食管手术史者；②有消化道相关器质性病变、消化性溃疡、贲门迟缓以及消化道手术史、肿瘤史者；③孕妇、哺乳期妇女；④严重心、肺、肾、肝、脑及恶性肿瘤史者；⑤有重大精神疾病、沟通障碍者；⑥其他严重疾病及意识不清者。

1.3 研究方法

内镜下收集入组患者食管黏膜标本，RE患者于食管黏膜糜烂明显处用活检钳取组织标本，NERD患者和正常对照组患者于食管齿状线上方5 cm处用活检钳取组织标本，分别置于4%甲醛溶液固定、-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.1 实验用品

免疫组化试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；BCA试剂盒由Solarbio公司提供，TRPV1抗体由Abclonal公司提供，货号A8564，批号1152430201，β-actin抗体由Servicebio公司提供，货号GB12001，批号202205；TRPV1引物、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3.2 免疫组化检测TRPV1蛋白阳性染色情况

4%甲醛液固定组织标本，石蜡包埋，切片；进行常规脱蜡、水化、抗原修复，PBS洗涤，内源性过氧化物酶阻滞剂滴加在切片组织上，室温静置10 min；PBS洗涤，加入一抗、二抗、显色剂等，然后复染、脱水、透明、封片、镜检观察TRPV1在各组食管黏膜的着色情况。

免疫组化结果判定标准如下，阴性(-)：细胞未显示着色；弱阳性(+)：细胞为浅黄色；阳性(++)：细胞为棕黄色；强阳性(+++)：细胞为棕色。如果阳性细胞数>10%，则切片呈阳性。每张切片随机选取5个高倍视野,光镜下按阳性染色的细胞数和染色深浅分级[5]。

1.3.3 Western-blot检测TRPV1蛋白表达量

从-80 ℃冰箱中取出食管黏膜组织标本，提取各组织总蛋白；按照BCA试剂盒检测组织蛋白浓度；制备浓缩胶和分离胶，按上样体积上样、电泳；进行转膜、一抗和二抗孵育、化学发光；将凝胶图像扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的光密度值，以目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白表达量。

1.3.4 RT-PCR检测TRPV1 mRNA表达量

从-80 ℃冰箱中取出食管黏膜组织标本，Trizol法提取食管黏膜组织总RNA，严格按照反转录试剂盒合成cDNA，进行实时荧光定量PCR反应，引物序列如下，内参GAPDH上游引物：5′-GGA AGC TTG TCA TCA ATG GAA ATC-3′，下游引物：5′-TGA TGA CCC TTT TGG CTC CC-3′，扩增产物168 bp；TRPV1上游引物：5′-GTG ACG CTG ATT GAA GAC-3′，下游引物：5′-CCG ATG GTG AAC TTG AAC-3′，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循环40次，延伸60 ℃ 30 s。熔解曲线60 ℃→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。结果用2-ΔΔCT法计算TRPV1 mRNA表达量。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件，等级资料用百分率表示，不同组别百分率的比较采用非参数秩和检验，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；不符合正态分布的计量资料用M(Q1，Q3)表示，不同组别差异的比较采用Kruskal-Wallis非参数检验，两组间差异的比较采用Dunn′s 法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRPV1蛋白阳性染色结果

TRPV1蛋白在食管鳞状上皮和腺上皮的细胞膜及细胞浆均有表达，以细胞膜表达为主，三组总体比较，TRPV1蛋白在食管鳞状上皮阳性表达较多，有统计学差异(P<0.05)，在食管腺上皮阳性表达较少，无统计学差异(P>0.05)。进一步两两比较示，在食管鳞状上皮中，RE组和正常对照组、NERD组和正常对照组间TRPV1蛋白阳性表达有统计学差异(P<0.05)，其中食管鳞状上皮细胞膜阳性表达显著，RE组阳性、强阳性表达较多，NERD组阳性表达较多，正常对照组弱阳性表达较多；食管鳞状上皮细胞浆阳性表达欠佳，RE组仅可见极个别细胞浆阳性表达，NERD组细胞浆无阳性表达，正常对照组可见部分细胞浆弱阳性表达；RE组和NERD组间TRPV1蛋白阳性表达无统计学差异(P>0.05)，见图1、表1。

图1 三组患者TRPV1蛋白阳性染色免疫组化图谱(×200)

表1 NERD、RE、正常对照患者TRPV1蛋白阳性染色结果比较 [n(%)]

2.2 TRPV1蛋白表达量结果

总体比较，TRPV1蛋白表达在三组间有统计学差异(P<0.05)。进一步两两比较示，与RE组和正常对照组相比，NERD组TRPV1蛋白表达更为显著(P<0.05)；RE组和正常对照组间TRPV1蛋白表达无统计学差异(P>0.05)，见图2、表2。

2.3 TRPV1 mRNA表达量结果

总体比较，TRPV1 mRNA表达在三组间有统计学差异(P<0.05)。进一步两两比较显示，与NERD组和正常对照组相比，RE组TRPV1 mRNA表达更为显著(P<0.05)；NERD组和正常对照组间TRPV1 mRNA表达无统计学差异(P>0.05)，见表3。

图2 NERD、RE、正常对照患者TRPV1蛋白表达量条带图(1为NERD组，2为RE组，3为正常对照组)

表2 NERD、RE、正常对照患者TRPV1蛋白表达量结果比较

表3 NERD、RE、正常对照患者TRPV1 mRNA表达量结果比较

3 讨论

近些年我国GERD的发病率逐年升高，严重影响人们的生活质量[6]，部分GERD患者对抑酸药治疗效果不佳[7]，因此明确GERD症状产生机制对其治疗具有重要意义。已有研究证实，VH与NERD和功能性烧心显著相关，其在RE中研究较少。临床工作中发现，RE患者中也有较普遍的焦虑现象且与功能性胃肠病重叠存在，因此我们推测，除了NERD，VH也参与了RE的发生。

本研究针对RE、NERD患者食管黏膜的免疫组化结果发现，TRPV1蛋白在食管鳞状上皮细胞膜阳性表达显著，在RE组阳性、强阳性表达较多，在NERD组阳性表达较多，在正常对照组弱阳性表达较多；TRPV1蛋白在食管鳞状上皮细胞浆阳性表达欠佳，在RE组仅可见极个别细胞浆阳性表达，在NERD组细胞浆无阳性表达，在正常对照组可见部分细胞浆弱阳性表达。本研究RT-PCR结果显示TRPV1 mRNA表达在RE组显著高于NERD组和正常对照组。总体来说，TRPV1在RE中表达更为显著。前期有本研究组其他成员做的动物实验为基础，将大鼠贲门肌部分切开加幽门部分结扎作为RE模型[8]，发现TRPV1在RE大鼠模型下丘脑组织中表达增高。这与国内外研究结果一致。

TRPV1为非选择性阳离子通道[9]，是一种伤害性感受器，对酸尤其敏感，广泛存在于脊髓背角神经元的初级传入神经、三叉神经、迷走神经等，可被多种理化因素、炎症介质直接激活或敏化[10]，该通道激活后，大量钙离子内流，引起神经末梢去极化产生动作电位，释放降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)和P物质(Substance P，SP)[11]，这些物质可导致渗出和炎症反应[12]，引起痛觉敏感和烧心症状[13]。同时TRPV1蛋白上的多个调控位点可增强和敏感化TRPV1通道，使内脏敏感性增高，对其功能的实现具有重要作用，这可能是TRPV1引起GERD的主要机制。

文献报道TRPV1的表达与RE严重程度相关，RE患者食管黏膜损伤越重，其TRPV1表达越高[14]。实验表明，注酸大鼠背根神经中的TRPV1表达比未注酸大鼠显著升高[15]，而TRPV1敲除的大鼠对注酸反应不明显[16]。推测TRPV1通路可能会启动并维持酸介导的食管黏膜炎症、上皮屏障损害及食管高敏状态，且该过程与酸暴露时间、黏膜损伤严重程度密切相关[17]。

NERD患者可出现严重的反酸、烧心症状却无内镜下食管黏膜受损表现，所以又称其为“症状性GERD”[18]，且这部分患者中有很大比例表现出对抑酸剂效果欠佳，我们猜想，抑酸效果差的NERD患者出现症状是由于食管黏膜敏感性增高所致[19]。本研究Western-blot结果显示，TRPV1蛋白表达在NERD组显著高于RE组和正常对照组，推测与RE组相比，VH在NERD的发病机制中作用更显著。研究表明，当发生酸反流时，食管黏膜的TRPV1表达升高，胃肠道、下丘脑等其他部位的TRPV1表达也升高，使初级传入神经纤维和脊髓背角神经元兴奋，进而刺激中枢和外周神经系统兴奋[20]，使食管黏膜敏感性增加，对酸反应及疼痛的阈值下降，进而更易引起反酸、烧心症状。大量关于肠易激综合征的研究已经证实TRPV1 可以增高内脏敏感性，动物实验表明，TRPV1阻滞剂可降低内脏的敏感性[21]，而给予离体细胞酸刺激后TRPV1蛋白和mRNA表达均增加[22]。结合本研究结果及文献报道，我们推测TRPV1可能通过参与内脏高敏感而引起GERD发病[23]。

此外，本研究标本数量较少，研究范围较局限，问卷调查结果主观性较强，可能对实验结果造成一定影响。今后需扩大样本量、完善动物干预实验，进一步对TRPV1与GERD的关系及分子机制进行深入研究。

综上所述，TRPV1可能参与RE和NERD患者的食管黏膜损伤、内脏高敏感机制，可能为探索GERD药物治疗提供新靶点。