ADP-核糖基化样因子15与过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因单核苷酸多态性与糖尿病肾脏疾病的相关性研究

凃影叶，张洪江，2，康淳，杜飞，2，崔佳慧，邵薇，2，袁志敏，王伟杰，杨康鹃*

糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）是2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）最常见的并发症之一，在T2DM中DKD的发生率和死亡率仅次于心脏大血管病变［1］，遗传因素是其主要的发病机制之一。2009年RICHARDS等［2］通过全基因组关联分析发现，ADP-核糖基化样因子15（ADP-ribosylation factorlike 15，ARL15）基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs4311394的 G与 T2DM相 关，且携带G的个体与低水平血浆脂联素相关。近年来李瑷彤［3］研究发现，携带过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator receptor γ coactivator 1 α，PGC-1α）基因SNP rs7656250-C因子与延边地区人群T2DM及合并大血管病变高度相关，具有显性遗传模式特征。

目前，关于ARL15和PGC-1α基因的rs4311394、rs7656250位点联合作用与DKD患病关联性研究尚未见报道。本研究将针对上述两个基因SNP与DKD关系进行探究，旨在从基因角度分析DKD发生情况，为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018—2019年于延边大学附属医院和延吉市医院确诊的朝鲜族和汉族T2DM患者393例（记为T2DM组）、DKD患者90例（记为DKD组），同期选取在延边大学附属医院进行单位体检的健康人268例〔记为糖耐量正常组（NGT组）〕。受试者均来自延边朝鲜族自治州，并在此居住10年以上；个体间无亲缘关系。本研究经延边大学伦理委员会审批，受试者均对本研究知情同意。

T2DM组纳入标准［4］：空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；排除标准：1型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊类型糖尿病。

DKD组纳入标准：符合《糖尿病肾病防治专家共识（2014年版）》［5］中的DKD诊断标准；估计肾小球滤过率（eGFR）< 60 ml·min-1·（1.73 m2）-1。排除标准：由其他原发病变导致的肾脏损伤。

NGT组纳入标准：FPG 3.9～6.1 mmol/L，血脂、肌酐（Cr）均在参考范围。

NGT组中汉族137例，朝鲜族131例；T2DM组中汉族205例，朝鲜族188例；DKD组中汉族55例，朝鲜族35例。

1.2 生理、生化指标采集方法 受试者均在空腹、净重状态下测量身高（cm）、体质量（kg）、腰围（cm）、臀围（cm），计算并记录其体质指数（BMI）及腰臀比（WHR）。

取受试者清晨空腹静脉血2 ml，1 609×g离心10 min 10 s分离血清，采用全自动生化分析仪检测FPG、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、Cr、尿素氮（BUN）及尿酸（UA）；采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清ARL15、脂联素蛋白水平。

鉴于PGC-1α蛋白含量在不同组织器官中的表达差异较大，且外周血中PGC-1α蛋白含量的干扰因素较多，无法精准控制变量，因此未对PGC-1α蛋白水平进行检测［6-7］。

1.3 DNA的提取 采用EDTA抗凝管收集外周血2 ml用于基因检测，操作流程严格按照AxyGene小量全血基因组DNA提取试剂盒使用说明进行，详细提取流程参考本课题组前期研究［3］。随后进行1%琼脂糖电泳，并对DNA浓度及纯度进行测定。

2 结果

2.1 DNA提取结果 加样电泳后的胶膜在紫外分光光度计下有荧光条带显示，表明DNA提取有效。

2.2 PCR结果 图1为ARL15基因rs4311394位点的4个样品，PCR扩增产物的长度为91 bp；图2为PGC-1α基因rs7656250位点的4个样品，PCR扩增产物的长度为75 bp。

图1 rs4311394 PCR扩增产物结果Figure 1 The amplification product result of rs4311394

图2 rs7656250 PCR扩增产物结果Figure 2 The amplification product result of rs7656250

2.3 测序结果 751例研究对象DNA测序结果：ARL15基因rs4311394位点和PGC-1α基因rs7656250位点测序结果见图3～4，其中rs4311394位点测序结果采用的是其互补链，测序图中野生型位点T对应为统计结果中的A，突变型位点C对应为统计结果中的G。

图3 ARL15基因rs4311394位点测序图Figure 3 Sequence map of the SNP rs4311394 of ARL15 gene

图4 PGC-1α基因rs7656250位点测序图Figure 4 Sequence map of the SNP rs7656250 of PGC-1α

2.4 等位基因频率、基因型频率分析

2.4.1 NGT组汉族和朝鲜族人群ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率分析 NGT组人群3种基因型分布经卡方检验符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05），具有群体代表性。

NGT组汉族和朝鲜族人群ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1～2。

表1 NGT组汉族和朝鲜族人群ARL15基因rs4311394位点等位基因频率、基因型频率比较〔n（%）〕Table 1 Comparison of allele and genotype frequencies of rs4311394 in ARL15 in Yanbian Korean and Han individuals in NGT group

表2 NGT组汉族和朝鲜族人群PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率比较〔n（%）〕Table 2 Comparison of allele and genotype frequencies of rs7656250 in PGC -1α in Yanbian Korean and Han individuals in NGT group

2.4.2 三组ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率比较 三组ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点基因型频率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3～4。

表3 三组ARL15基因rs4311394位点等位基因频率、基因型频率比较〔n（%）〕Table 3 Comparison of allele and genotype frequencies of rs4311394 in ARL15 in three groups

表4 三组PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率比较〔n（%）〕Table 4 Comparison of allele and genotype frequencies of rs7656250 in PGC -1α in three groups

2.4.3 三组ARL15、PGC-1α基因联合位点等位基因频率、基因型频率比较 三组ARL15、PGC-1α基因联合位点等位基因频率、基因型频率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表5。

表5 三组ARL15、PGC-1α联合基因型与疾病的关联分析〔n（%）〕Table 5 Association analysis of two SNPs combined genotypes of ARL15 and PGC-1α and diseases in three groups

2.4.4 受试者ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点基因型与生理、生化指标的关联分析PGC-1α基因rs7656250位点不同基因型者FPG、脂联素水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中携带PGC-1α基因rs7656250位点CT基因型受试者FPG水平高于CC、TT基因型受试者，差异有统计学意义（P<0.05）；携带PGC-1α基因rs7656250位点CT、TT基因型受试者脂联素低于CC基因型受试者，TT基因型受试者脂联素低于CT基因型受试者，差异有统计学意义（P<0.05），见表6～7。

表6 受试者ARL15基因rs4311394位点基因型与生理、生化指标的关联分析〔M（P25，P75）〕Table 6 Association analysis of the genotype of rs4311394 in ARL15 with physiological and biochemical indices

表7 受试者PGC-1α基因rs7656250位点基因型与生理、生化指标的关联分析Table 7 Association analysis of the genotype of rs7656250 in PGC -1α with physiological and biochemical indices

2.5 三组ARL15、脂联素比较 三组ARL15、脂联素比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中T2DM组患者脂联素低于NGT组，差异有统计学意义（P<0.05）；DKD组患者ARL15、脂联素高于NGT组、T2DM组，差异有统计学意义（P<0.05），见表8。

表8 三组ARL15、脂联素比较〔M（P25，P75）〕Table 8 Comparison of levels of ARL15 and adiponectin in three groups

2.6 DKD组患者ARL15与生化指标的相关性分析Spearman秩相关分析结果显示，ARL15与BMI、WHR、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Cr、BUN、UA无相关关系，与脂联素呈正相关（P<0.05），见表9。

表9 DKD组患者ARL15与生化指标的相关性分析Table 9 Association analysis between ARL15 and biochemical indices in DKD group

3 讨论

T2DM是一种以体内糖、脂代谢紊乱为特征的代谢性疾病，体内长期高血糖、胰岛素抵抗以及血脂异常是其一系列并发症出现的主要原因［8］。近年来，尽管系统性降压和降糖治疗使得包括心血管疾病及糖尿病足在内的T2DM并发症减少了60%～70%，但DKD的发病率依然居高不下，成为T2DM患者主要的死亡原因之一［9］。DKD早期，高血糖导致肾小球高滤过、肾小球系膜扩张、蛋白尿及肾小球毛细血管基膜增厚，随着病程进展，肾小球滤过率降低，肾小球及肾小管间质纤维化，最终导致肾衰竭。目前，对于DKD发病机制的研究尚不完全，主要认为高血糖可通过多种途径参与DKD的发生发展，包括异常代谢、血管生成素的过度表达、糖基化终末产物的生成等［10］。

CUI等［11］研究结果显示，中国延边地区朝鲜族人群中ARL15基因rs26770位点的GG基因型与T2DM患病高度相关。GAYATHRI等［12］研究结果显示，PGC-1α基因Gly482Ser多态性与亚洲印度人罹患DKD相关。既往研究还显示，ARL15和PGC-1α的联合作用与血浆中脂联素水平密切相关［3］，而脂联素与T2DM及DKD的发生发展密切相关［13］。因此，笔者推断ARL15和PGC-1α的联合作用与DKD的发生之间可能存在相关性，且多位学者发现在非洲西部、亚洲地区人群以及非裔美国人体内血浆脂联素水平与肾脏功能存在关联性［14-16］，为本研究设计提供了理论依据。

本研究结果显示，NGT组汉族和朝鲜族人群ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率之间差异无统计学意义，认为可能与延边地区朝鲜族与汉族人群通婚现象比较普遍，且未将家族谱系列入筛选指标，故在后续研究中将朝鲜族与汉族人群进行合并分析，将疾病情况作为主要分组依据。本研究结果还显示，三组ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点的等位基因频率与基因型频率差异无统计学意义，且上述两个位点的联合基因型在三组间差异无统计学意义，表明ARL15基因rs4311394位点与PGC-1α基因rs7656250位点并不是导致DKD与T2DM患者发病的直接因素。

在T2DM及DKD患者体内，血糖、血脂异常同时存在，有研究表明，在高糖环境中PGC-1α水平明显下降，与肾皮质线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加、蛋白尿增多、肾小球硬化及系膜增生呈相关性［17］。同时，体内低水平的PGC-1α还可使蛋白-线粒体分裂蛋白（DRP-1）表达增加，导致线粒体的重构，并与TG、TC升高相互促进，进一步加重肾脏病变。近期研究发现，提高PGC-1α的活性是治疗急性肾损伤和慢性肾脏疾病的有力措施之一［18］。

IWABU等［19］研究发现，在肥胖情况下，PGC-1α的表达下降与脂联素及其受体水平的降低、线粒体功能失调存在因果关系。本研究结果显示，NGT组汉族和朝鲜族人群ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率比较，差异无统计学意义；而携带PGC-1α基因rs7656250位点CT基因型受试者FPG水平高于CC、TT基因型受试者；携带PGC-1α基因rs7656250位点CT、TT基因型受试者脂联素低于CC基因型受试者，TT基因型受试者脂联素低于CT基因型受试者。有研究表明，脂联素水平与血糖值呈负相关［3］，T2DM与DKD患者体内脂联素水平降低，脂肪细胞的分泌与血糖水平增高，而体内糖、脂代谢紊乱是DKD发病机制的关键一环，提示PGC-1α基因rs7656250-T可能为T2DM和DKD患者发病的影响因素之一。

本研究结果显示，T2DM组脂联素低于NGT组；DKD组ARL15、 脂 联 素 高 于NGT组、T2DM组；Spearman秩相关分析结果显示，ARL15与脂联素呈正相关。NANAYAKKARA等［20］研究结果也证实了，在慢性肾脏病患者中脂联素水平与eGFR之间存在负相关，而PALMER等［22］研究结果显示，肾功能下降率（即eGFR的斜率）与包括肾小球硬化和系膜溶解在内的肾小球病变高度相关。一项最近的研究结果显示，40%～50%的DKD患者在没有出现蛋白尿的情况下出现了eGFR的降低，表明在DKD的发生发展中，eGFR可能是一个更为敏感的临床指标［22］。当DKD患者体内血清脂联素水平上调时，eGFR呈下降的趋势，表现为肾脏功能的减退。

本研究尚存在一定的局限性。首先，在研究对象方面，由于临床数据的不足，样本的生理、生化指标采集并不充分，且在以民族为分组的分析中未将家系作为排除指标，这可能是导致ARL15基因rs4311394位点与PGC-1α基因rs7656250位点在延边地区朝鲜族与汉族中差异无统计学意义的原因之一。其次，由于PGC-1α蛋白的特殊性，本研究未对其进行检测，下一步本课题组将继续查阅文献，以期在后期试验中可以加入这项指标。

综上所述，本研究虽然未发现ARL15、PGC-1α基因SNP与T2DM、DKD的相关关系，但一定程度上证明了携带PGC-1α基因rs7656250位点的CT、TT基因型人群体内脂联素水平明显降低，推测rs7656250-T可能为T2DM和DKD患病的影响因素，为T2DM及DKD的遗传易感性提供一定的遗传学理论依据。

作者贡献：凃影叶主要负责研究方案的设计、全程参与实验的操作、最终数据统计及论文的撰写；张洪江协助进行相关实验，处理数据；康淳、杜飞、崔佳慧、邵薇和袁志敏协助数据收集，进行论文的校正，英文的修订；王伟杰和杨康鹃对文章的可行性进行分析，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。

本研究链接：

近年来，随着糖尿病确诊人数的逐年攀升，糖尿病肾脏疾病（DKD）的发病率也从25.4%上升到27.1%，是1型糖尿病的主要死因，而在2型糖尿病中DKD的发生率和死亡率也仅次于心脏大血管病变。DKD作为一种由长时间高血糖、胰岛素抵抗和血脂紊乱而引发的肾脏微血管病变，病变初期，体内长期高血糖导致肾小球高滤过，肾小球入球小动脉扩张。随着病程进展，逐渐出现肾小球毛细血管基底膜的增厚以及肾间质的纤维化，最终导致终末期肾衰竭的发生。根据目前的研究，DKD的发病机制非常复杂，主要与糖代谢紊乱、血流动力学异常、炎性反应、氧化应激及遗传因素相关，由于DKD是一种多基因遗传病，故遗传因素在DKD的遗传易感性上起重要作用。