环状RNA Hsa_circ_0046701在胶质瘤中的表达及临床价值

张 钦，田 博，李张珂

（1.海南省妇女儿童医学中心神经科学部神经外科，海南 海口 5 70300；2.空军军医大学第二附属医院神经外科，陕西 西安710038；3.西安国际医学中心医院神经外科，陕西 西安 7 10100）

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，死亡率、复发率高。当今主流治疗方案是手术切除，术后辅以放疗、化疗提高疗效，相关治疗近30年无突破性进展。为提高手术疗效、进而提高患者生存率、降低复发率，对胶质瘤的发病机制和治疗方案进行更深层次地研究是十分必要的［1］，而探明胶质瘤相关的特异标志物是研究其发生发展中重要的一环。

环状RNA（circular RNA，circ-RNA）是一类内源性非编码RNA，具有稳定性好、特异性高、含量丰富等特点，是一种极具潜能的生物标志物。此外，circ-RNA在基因表达调控中发挥重要作用，与肿瘤的形成与发展也有着密切关系［2］。已报道的癌症机制研究中提示，一些基因与癌症的发生发展等有关。有关胃癌的研究报告表明，hsa_circ-0000745表达水平与肿瘤分化程度、转移、TNM分期有明显相关性［3］；还有研究发现circ-ITCH与肺癌细胞的增殖有密切关系，circ-ITCH通过结合miR-7和miR-211发挥抑癌作用，上调circ-ITCH可以抑制肺癌细胞的增殖［4］；胶质瘤中circ-FBXW7-185aa的表达水平明显下降，同样circ-FBXW7-185aa有着抑制肿瘤细胞增殖的功能［5］。hsa_circ_0046701与胶质瘤的发生发展有关，先前的基础研究表明hsa_circ_0046701在胶质瘤组织和细胞中表达明显上调，并且hsa_circ_0046701基因的敲除抑制了肿瘤细胞的增殖和侵袭［6］。然而，hsa_circ_0046701对患者的预后的影响尚未可知，是否可以将其作为改善患者预后的生物标记物有待进一步去探索。本研究结合临床随访数据，分析了hsa_circ_0046701不同表达水平对临床预后的影响，初步探讨了hsa_circ_0046701的表达在脑胶质瘤中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取自2010年7月～2015年1月在空军军医大学第二附属医院神经外科行手术切除的胶质瘤患者，共纳入55例hsa_circ_0046701表达阳性的患者，男性34例，女性21例，年龄28～77岁。所有病例术前未接受过放疗、化疗、手术和细胞免疫治疗，且未合并有其他肿瘤。选择15例颅脑创伤行开颅治疗的患者，取术中损伤的脑组织标本作为对照组。本研究获得了空军军医大学第二附属医院的批准，患者或其家属签署了知情同意书。

1.2 实验方法

患者均在术前接受常规术前检查，并在全麻的状态下行胶质瘤切除术。手术过程中，由同一名主刀医师切取瘤组织和正常脑组织标本。对所得样本进行病理学检测：（1）TRIzol法提取标本组织中的总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA浓度，选用OD260/280在1.8～2.1的标本；（2）用逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA；（3）按照qRT-RNA试剂盒说明进行扩增，检测hsa_circ_0046701的表达水平hsa_circ_0046701引物序列为上游：5'-CACAACCAGAGCACAATTTGA-3'下 游：5'-TGGATCATCAACCAGCTCAG-3'。以上检验均重复3次。

1.3 统计学处理

应 用SPSS22.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）统计分析所得数据。以（±s）表示hsa_circ_0046701的相对表达量，并用单因素方差分析或t检验比较组间的差异。应用χ2检验，分析胶质瘤患者hsa_circ_0046701高表达组与低表达组患者的临床病理特征有无差异。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线后用Log-rank检验分析不同hsa_circ_0046701表达量患者的生存率。最后用Cox比例风险回归模型进行预后的单因素和多因素分析，评估hsa_circ_0046701表达水平对临床预后的影响。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hsa_circ_0046701在胶质瘤组织中的表达显著上调

qRT-PCR的检测结果显示hsa_circ_0046701在胶质瘤组织中的表达水平明显高于对照组脑组织（正常组织vs.WHOⅠ～Ⅱ级：1.000±0.193vs.2.588±0.332，P=0.002）。此 外，WHO分 级 中hsa_circ_0046701在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中的表达高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤（3.602±0.228vs.2.588±0.332，P=0.031）。见图1。

图1 Hsa_circ_0046701在胶质瘤组织Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ级和正常组织中的表达水平Fig 1 Expression levels of hsa_circ_0046701 in normal tissues and glioma tissues in gr adeⅠ-Ⅱand gradeⅢ–Ⅳ

2.2 胶质瘤患者hsa_circ_0046701表达水平与临床病理特征的关系

根据hsa_circ_0046701表达量的均值（3.014±0.285）将患者分为高表达组29例和低表达组26例。通过对患者临床病理指标的比较，发现hsa_circ_0046701的高表达与高WHO分级（P=0.011）、KPS评分（P=0.002）以及患者术后复发（P=0.002）有关系，与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤部位等均无关系。见表1。

表1 Hsa_circ_0046701表达水平与胶质瘤患者临床病理指标的关系Tab 1 The relationship between hsa_circ_0046701 ex⁃pression level and clinicopathologic indexes in patients with giloma

2.3 Hsa_circ_0046701水平与胶质瘤患者预后关系

利用Kaplan-Meier法进行生存分析，绘制患者术后5年生存率曲线，通过Log-rank检验，结果表明：与hsa_circ_0046701低表达组相比，高表达组预后较差，术后生存期明显缩短，差异具有统计学意义（P=0.040 4）。见图2。

图2 Hsa_circ_0046701高、低表达组术后生存率比较Fig 2 Comparison of postoperative survival rates between the high hsa_cir c_0046701 expr ession group and the low hsa_circ_0046701 expression group

采用Cox比例风险回归模型进行患者预后的单因素和多因素分析，结果显示：hsa_circ_0046701表达水平、高WHO分级、KPS评分、术后复发是影响胶质瘤患者预后的危险因素。见表2。

表2 胶质瘤患者不同临床病理特征和hsa_circ_0046701表达的单因素和多因素分析表Tab 2 Univariate and multivariate analysis of different clinicopathological features and hsa_circ_0046701 expression in patients with glioma

3 讨论

胶质细胞瘤的生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏脑组织，恶性者瘤体生长快，病程短，发病机制复杂，放疗、化疗、手术等疗效有限，预后复发率高、死亡率高［7］。目前，临床对于胶质瘤的诊断治疗及对预后的预判方面仍然缺少合适的生物标志物。因此，寻找与胶质瘤发生发展及预后密切相关的特异性生物标志物具有重要的临床意义［8］。

环状RNA是近年来的新兴分子，最先在RNA病毒中被发现，在1970年，真核生物核细胞质中也证明了circRNA的存在。最初认为其是因错误连接而形成的低丰度分子，但随着生命科学技术的不断进步，越来越多的circRNA的功能不断凸现出来［9］。目前，已发现circRNA可以内源性竞争性抑制miRNA结合，调控亲代基因表达，调控RNA结合蛋白等的作用，circRNA的差异表达也与多种疾病的发生发展密切相关，尤其在肿瘤方面［10-13］。由于circRNA不易被核酸酶降解，具有保守性高，为其作为疾病诊疗及预后的特异标记物奠定了基础。例如：肝细胞肝癌中，hsa_circ_0004018明显下调，其表达水平与肿瘤大小、分化程度、WHO分级的相关性有统 计 学 意 义［14，15］；hsa_circ_0047905，hsa_circ_0138960，hsa_circRNA 769015的上调与胃癌细胞增殖和侵袭高度相关，抑制这3种circRNA的表达可明显缓解胃癌的进展［16］。有研究发现hsa_circ_0046701在胶质瘤组织和细胞中过表达，通过竞争性抑制miR-142-3p结合蛋白促进胶质瘤的进展［6］。但hsa_circ_0046701在临床的诊疗和预后方面的研究尚未有报道，本研究旨在通过检测hsa_circ_0046701在胶质瘤组织及正常组织中的表达水平来分析其对患者预后的影响。

本研究采用RT-PCR技术检测hsa_circ_0046701在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达量，进行统计分析，结果显示，与正常脑组织相比，胶质瘤中hsa_circ_0046701的表达水平明显升高，且与肿瘤恶性程度有关。笔者进一步研究了胶质瘤患者hsa_circ_0046701表达水平与临床病理特征的关系，研究结果显示：hsa_circ_0046701的高表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、数目、部位等均无关，而与WHO分级、KPS评分及患者术后复发有关。这提示hsa_circ_0046701的表达水平与胶质瘤的侵袭性、增殖能力有关，通过抑制其表达可延缓肿瘤发展。最后，通过分析Hsa_circ_0046701表达量与胶质瘤患者预后的关系，发现与hsa_circ_0046701低表达组相比，高表达组5年生存率较低，同时还证实了hsa_circ_0046701表达水平、WHO分级、KPS评分＜80分，术后复发是影响胶质瘤患者预后的危险因素，可将其作为临床预后的指标，为早期胶质瘤诊断和干预提供参考依据。

综上所述，hsa_circ_0046701表达水平在胶质瘤进展中有十分重要的作用，与患者预后情况有关，可作为一个潜在候选因子进行进一步研究。后续研究可对hsa_circ_0046701的分子生物学功能进行进一步检测，明确其机制，为胶质瘤的早期诊断、治疗及预后评估提供新的证据。

作者贡献度说明：

张钦：设计研究思路，指导收集资料和数据分析，撰写论文；田博：收集资料和数据分析；李张珂：设计研究思路，指导收集资料和数据分析，对文章进行审阅和修改。