电针针刺内关、郄门穴对急性心肌缺血模型大鼠心肌能量代谢的影响

周 婧，丁 丽，邓 坤，章 燕，李广兵，朱 涛，周 巧，王 堃，张 宸

（1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥，230061；2.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 2 30038；3.安徽中医药大学，安徽 合肥 2 30038）

心肌缺血是指心肌因灌注的血液减少，供氧降低，导致心脏的供血供氧减少进而使心肌不能正常进行能量代谢，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。其中，冠状动脉的阻塞造成心肌的缺血缺氧是心肌缺血疾病的主要原因。改善缺血心肌的能量代谢是治疗心肌缺血的重要作用靶点［1］。作为葡萄糖酵解的产物之一的游离脂肪FFA是心肌能量代谢标记物，心肌缺血时，其在心肌细胞内过度堆积，进而引起细胞能量代谢的紊乱、细胞的凋亡［2］。心肌能量代谢过程中的包括FFA在内的各种底物经氧化磷酸化形成ATP，为心肌细胞代谢提供能量［3］。Na+-K+-ATP酶广泛存在于各器官以及组织细胞膜表面的酶蛋白，通过水解ATP时所释放的能量，参与心肌能量代谢，与心肌细胞能量代谢的过程密切相关［4］。相关临床及循证研究表明，针灸可改善缺血心肌，对缺血心肌产生保护作用，改善能量代谢［5-7］，但对于手厥阴心包经，尤其对于内关及其善治急性疾病之郄穴郄门的相关研究较少，此外众多研究大多从改善心肌缺血角度出发，进而探讨通过改善缺血而改善心肌能量代谢，本研究通过结扎冠状动脉制备急性心肌缺血大鼠模型，研究电针针刺手厥阴心包经腧穴中的内关及郄门穴对急性心肌缺血大鼠模型心肌能量代谢的影响，从心肌能量代谢过程中心肌能量的产生、转化、储存等角度，研究缺血心肌能量代谢过程中的相关环节指标，探讨针刺治疗在缺血心肌能量代谢中的重要作用，为针灸临床治疗心肌缺血、改善心肌能量代谢提供一定的实验基础研究。

1 材料与方法

1.1 动物

标准Spargue-Ddwely（SD）雄性大鼠40只；由安徽医科大学（实验动物中心）提供，生产许可证为：SCXK（皖）2011-002，按照标准统一喂养于安徽中医药大学动物房内，适应性饲养前大鼠体重约为190～250 g，光照大约14 h/d，温度控制于20℃～26℃，相对湿度达40%～70%。本动物实验通过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 仪器与试剂

XD7100型心电图记录仪（上海医用电子仪器）；台式高速冷冻离心机（Heal Forc）；切片机（Leica RM 2135德国）；酶标仪（BioTeK）；移液器（Thermo Finnpipette美国）。

全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技）；切片漂烘仪（科力飞QP-B合肥电子研究所）；石蜡包埋机（亚光YB-7B湖北 孝感）等；FFA、ATP酶、Na+-K+-ATP酶（南京建成生物工程研究所）；苏木素，伊红（珠海贝索生物技术有限公司）。

1.3 实验方法与分组

1.3.1 动物分组 40只标准SD大鼠于实验前统一适应性喂养，1周后将其随机分为4组，每组均10只，称重并进行相应标记，即假手术组、模型组、内关组、郄门组。

1.3.2 造模及模型鉴定 采用冠脉结扎的方法制备急性心肌缺血大鼠模型［8］。造模开始前禁食不禁水12 h，各组大鼠称重，记录，大鼠腹腔注射3.5%戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉后，将大鼠以仰卧位固定于手术操作台，密观大鼠的生命体征，待其生命体征平稳后，记录下术前各组大鼠的心电图。左胸手术区备皮、消毒后剪开术部的皮肤，钝性分离打开胸腔后迅速挤压右胸，轻压胸壁并快速挤出心脏，结扎冠状动脉以备制心肌急性缺血模型。监测大鼠心电图的动态变化，记录心电图，观察Ⅱ导联心电图，以ST段持续性抬高作为模型成功的标志。假手术组各大鼠只穿线不结扎。

1.4 穴位选取与电针针刺方法

参照人体经脉循行路线，结合《实验针灸学》［9］关于大鼠针灸穴位定位标准，测量后折算确定大鼠穴位定位为：内关穴位于前肢内侧，离腕关节约3 mm的尺桡骨缝间；郄门：前肢内侧，离腕关节约6 mm的尺桡骨缝间。

造模成功后，选择各项生理指标平稳的时间点作为0 min开始标记，分别针刺内关组、郄门组，并接电针。取穴为双侧内关穴、双侧郄门穴。将同侧电极一端接在腧穴针柄上，一端接在大鼠尾部，防止电流过心。采用0.25 mm×50 mm银质毫针垂直刺入斜刺2 mm，接电针仪，疏密波，频率2～50 Hz，强度1～2 mA，强度以大鼠肢体微微颤动为宜，留针20 min，每天一次（上午8：00～11：00）。针刺期间，模型组、假手术组不做电针处理，但每天在同一时间，使用与针刺组相同的方法进行抓取和固定。每天1次，连续14 d。

1.5 标本采集及检测方法

电针治疗14 d后各组大鼠开胸截取心肌组织标本，立即置于液氮中冷冻−80℃中保存，测定时取出。

1.5.1 心肌病理学 将取出的心脏标本于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后制成数张4μm厚切片，HE染色，观察心肌组织病理学改变。

1.5.2 血清FFA、ATP含量及Na+-K+-ATP酶活力测定 分别选取心肌组织200 mg，制备10%的组织匀浆，3 500 r/min，离心10 min，取上清液，测游离脂肪酸FFA、ATP含量及Na+-K+-ATP酶活力，具体操作参照试剂盒说明书。

1.6 统计学处理

所有数据采用SPSS 21.0统计学软件进行分析处理，计量资料以（±s）表示。符合正态分布、方差齐性资料使用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义；不符合方差齐性的资料，使用Kruskal-Wallis检验。两组间比较用t检验或秩和检验。

2 结果

2.1 一般情况

实验结束后，假手术组无大鼠死亡，10只大鼠全部存活；模型组与内关组各死亡2只大鼠，剩余8只；郄门组1只大鼠死亡，剩余9只；造模后心电图表现为ST段持续性抬高，提示急性心肌缺血模型大鼠造模成功，见图1。

图1 大鼠造模前后心电图的变化Fig 1 Changes of EKG in rats before and after modeling

2.2 对急性心肌缺血大鼠心肌病理学的影响

HE染色结果可见，假手术组大鼠心肌纤维紧凑，排列整齐，组织间隙未见明显增宽等病理改变，细胞核清晰，呈圆形或椭圆形。模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，组织间隙增宽，细胞核形态显示不清，分散，部分核减少，甚至消失，炎症细胞浸润，提示本实验冠脉结扎致心肌梗死大鼠模型建立成功；内关组、郄门组以上形态学改变均有不同程度改善。见图2。

图2 光镜下各组心肌组织病理学改变（HE染色，200×）Fig 2 Histopathological changes of myocardium in each group under light microscope（HE staining，200×）

2.3 对急性心肌缺血大鼠FFA的影响

与假手术组相比，模型组、郄门组、内关组中FFA含量增多，其中模型组、郄门组差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，郄门组、内关组FFA含量减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠FFA含量的比较（±s）Tab 1 Comparison of the contents of FFA in each group ofrats（±s）

表1 各组大鼠FFA含量的比较（±s）Tab 1 Comparison of the contents of FFA in each group ofrats（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

FFA（μmol/g）171.32±12.82 241.54±20.26*199.90±27.16*#184.79±16.34#20.211＜0.001 n组别假手术组模型组郄门组内关组10 898 FP

2.4 对急性心肌缺血大鼠ATP含量的影响

与假手术组相比，模型组、郄门组、内关组ATP含量减少，其中模型组差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，郄门组、内关组ATP含量增多，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠ATP含量的比较（±s）Tab 2 Comparison of the contents of ATP in each group of rats（±s）

表2 各组大鼠ATP含量的比较（±s）Tab 2 Comparison of the contents of ATP in each group of rats（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

ATP（μmol/g）217.66±49.64 163.80±15.94*202.69±33.92△201.01±33.51△3.399 0.030 n组别假手术组模型组郄门组内关组10 898 FP

2.5 对急性心肌缺血大鼠Na+-K+-ATP酶活力的影响

与假手术组相比，模型组、郄门组、内关组Na+-K+-ATP酶活力降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，郄门组、内关组Na+-K+-ATP酶活力增高，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠Na+⁃K+⁃ATP酶活力的比较（±s）Tab 3 Comparison of NA+⁃K+⁃ATP enzyme activity in each group of rats（±s）

表3 各组大鼠Na+⁃K+⁃ATP酶活力的比较（±s）Tab 3 Comparison of NA+⁃K+⁃ATP enzyme activity in each group of rats（±s）

注：与假手术组比较，▲P＜0.05，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，#P＜0.01。

Na+-K+-ATP（μmol/mg）8.29±0.47 6.41±1.02*7.23±0.70*△7.53±0.83▲#9.174＜0.001 n组别假手术组模型组郄门组内关组10 898 FP

3 讨论

急性心肌缺血主要是因冠状动脉急性、持续性的缺血缺氧进而造成心肌坏死，具有发病急、发病快、致残及死亡率高的特点，威胁人类健康［10］。急性心肌缺血后，心脏血液灌注减少，供血供氧减少，心肌组织细胞坏死，能量代谢出现异常，影响心脏正常工作。传统西医在治疗心肌缺血，改善能量代谢方面，发挥着重要的作用，但目前临床可用的相关针对性药物少，作用不明显。缺血性心脏病属于祖国医学“胸痹”范畴，其病机责之为“本虚标实”，主要以益气温阳，活血化瘀，豁痰通络为治疗大法。针刺作为祖国医学的瑰宝，在长期的医疗实践中积累了丰富的临床经验，在治疗心血管疾病中疗效显著。大量临床及动物实验证实，针刺在改善缺血心肌，保护缺血心肌等方面发挥了重要作用。

正常心肌能量代谢过程主要涉及底物的利用、底物氧化磷酸化以及ATP的转运利用三个方面［11］。急性心肌缺血时，涉及能量代谢过程中任何环节出现问题都会对心肌正常的能量代谢产生影响。心肌能量代谢过程中的主要底物是FFA，FFA和葡萄糖等其他底物一起在线粒体中合成乙酰辅酶A并进入三羧酸循环氧化，进行氧化磷酸化，最终释放大量的ATP，为心肌收缩提供大量能量［12］，为维持心脏正常生理功能活动提供直接能量来源。Na+-K+-ATP等是细胞膜的重要蛋白酶之一，与Ca2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶等共同参与调节Ca2+浓度的稳定，使心肌线粒体维持正常生理活动［13］，常作为判断能量代谢是否紊乱及组织损伤恢复能力的指标之一［14］。心肌急性缺血后，作为心肌能量底物之一的FFA优先转变为优先利用葡萄糖，导致FFA在心肌组织和血清中大量堆积［11］，此时心肌细胞能量获取途径发生改变，转变为葡萄糖无氧酵解，ATP含量减少［15］，进而Na+-K+-ATP酶活性受抑制，造成钙超载［16］，进一步加重线粒体损伤，恶性循环造成心肌能量代谢紊乱，心肌细胞受损。

针刺作为祖国医学重要的治疗手段之一，可降低心肌耗氧，增加冠脉血流等，从而发挥保护缺血心肌的作用，治疗心肌缺血性心脏疾病［17，18］。《灵枢·经脉》记载：“心主手厥阴心包络之脉，起于胸中，出属心包络，下膈而历络三焦……是主脉所生病者，烦心、心痛......”。《灵枢·邪客》中记载：“诸邪之在于心者，皆在于心之包络，包络者，心主之脉也”，提出“心包代心受邪”的观点。根据“经脉所过，主治所及”的理论，心包经腧穴可治疗心的疾病。《针灸甲乙经》中记载曰：＂急则必暴痛，而虚则烦心，也惕惕不能动、失智者，内关主之也……”。“心胸内关谋”，内关为手厥阴经络穴、八脉交会穴之一，通于阴维脉，是治疗心胸疾病的首选要穴，也是治疗缺血性心脏病的常用腧穴［19，21］，可是目前治疗缺血性心脏病常用腧穴中使用频率最高的心包经腧穴［22］。相关实验研究显示，针刺内关穴，可调节心肌缺血再灌注大鼠的糖代谢及能量代谢［23］，逆转缺血心肌的ATP敏感型钾通道以及其结合蛋白与蛋白激酶［24］，保护缺血心肌。郄门穴是手厥阴心包经的郄穴，“郄主急”，具有缓急止痛和急救的作用。《针灸甲乙经》记载：“郄门，手心主郄……治心痛”。相关实验表明，心肌缺血时，通过针刺郄门穴可支配心脏的传出神经，可影响心肌细胞电活动、心肌收缩、抑制心肌细胞凋亡、减轻Ca2+超载以上调钙网蛋白表达，从而改善缺血心肌，保护心肌细胞［25，26］。

本实验研究显示，电针针刺手厥阴心包经之腧穴内关、郄门，可改善缺血心肌的细胞损伤。内关组、郄门组经电针针刺干预后，与模型组内大鼠体内FFA含量增多，ATP含量降低，Na+-K+-ATP酶活性降低相比，内关组、郄门组其FFA含量减少，ATP含量增多，Na+-K+-ATP酶活性增高。综上，通过实验发现：电针针刺手厥阴心包经之内关、郄门穴可以不同程度地改善心肌缺血状态，减轻急性心肌缺血后梗死心肌的损伤，保护缺血的心肌，同时改善缺血心肌能量代谢。本实验从代谢组学角度观察了电针针刺对缺血心肌及其心肌能量代谢的影响，但由于实验样本量少、针刺干预机制复杂多样，非单一因素决定等相关因素的限制或影响，电针针刺内关及郄门穴对于缺血心肌能量代谢的影响机制仍有待做进一步研究，今后需在此基础上不断深化研究，进行更深层次的相关机制探索，为针刺改善心肌能量代谢方面的研究提供一定的实验资料。

作者贡献度说明：

周婧：项目负责人，实验开展，数据统计及分析，文章撰写等；丁丽：实验研究方案及设计指导；邓坤、章燕、李广兵、朱涛：指导开展实验及数据统计；周巧：采购、动物及设备准备及开展实验；王堃：开展实验，模型制备等；张宸：协助开展实验及研究档案管理。