奥希替尼治疗脊髓损伤的机制研究*

李在望， 曹婷婷， 王 倩， 涂景梅， 韩 晶△

1暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院，深圳市人民医院神经内科，深圳 518020 2江苏省盐城市第一人民医院神经内科，盐城 224001

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)常导致永久性的神经功能缺损，给患者的生活质量带来灾难性的后果。SCI在各国均有较高的发病率，我国患病率为(23.7～60.6)/100万，且每年新增SCI病例高达60000例[1]。而SCI后神经损伤的病理生理机制目前尚未完全阐明，且医学界尚无有效的治疗方法[2]。

机械暴力损伤脊髓可导致血脊髓屏障(blood spinal cord barrier，BSCB)严重破坏，失去正常屏障功能，从而引发血液中的白细胞侵入中枢神经组织并分泌大量致炎因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、环氧化酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等[3]。这些致炎因子可激活小胶质细胞和星形胶质细胞[4]，最终引发反应性神经毒性炎症损伤，导致髄鞘脱失[5]和脊髓继发损伤进一步加重[6]。而且致炎因子还可导致BSCB中紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)的脱失，进而加重BSCB的损伤[7]，因此，SCI后反应性炎症损伤在脊髓继发损伤中起着至关重要的作用[8]。如何有效抑制SCI后的过度炎症反应是干预SCI的一个重要策略。

已有研究证实，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂可抑制SCI后过度胶质增生导致的反应性神经毒性炎症损伤[9-10]，而奥希替尼是第3代EGFR抑制剂，具有良好的血脑屏障渗透性，能有效地作用于中枢神经系统[11]。因此，我们拟用奥希替尼干预脊髓损伤大鼠模型，观察其对SCI早期(3、7 d)致炎因子(IL-1β、TNF-α、COX-2和iNOS)及紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)表达的影响，并分析其对炎症引发胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)活化增生的影响，同时研究其对SCI后髄鞘脱失的作用，评估其对SCI后神经功能恢复的促进作用。该研究结果将为临床应用EGFR抑制剂干预SCI提供可靠的实验依据和新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康成年雌性SD大鼠(200～250 g)60只，购自常州卡文斯实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂与材料 奥希替尼购于MCE公司，兔抗COX-2、兔抗iNOS、兔抗ZO-1、兔抗Occludin、兔抗GFAP抗体购于Invitrogen公司，兔抗EGFR、兔抗p-EGFR、鼠抗CD11b、鼠抗GAPDH抗体购于英国Abcam公司，鼠抗IL-1β、鼠抗TNF-α抗体购于美国R&D公司，羊抗兔Cy3、羊抗鼠Cy3购于武汉博士德生物工程有限公司，勒克司坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色试剂盒购于美国GenMed Scientifics公司。

1.2 大鼠脊髓损伤模型的制备及分组

实验大鼠随机分为3组(假手术组，损伤组和奥希替尼组)，每组20只。选择T10解剖标志，消毒铺无菌巾后行背部正中切口，切断T9～T11棘突上的韧带，暴露T9～T11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，充分暴露硬脊膜。假手术组大鼠不予打击损伤，止血后依次缝合竖脊肌、皮下组织及皮肤，碘伏清理局部皮肤，外用红霉素预防感染。损伤组和奥希替尼组大鼠，应用固定器固定T9、T11棘突，调整好打击棒的高度[打击棒重量为10 g，其打击头直径为2 mm，打击高度为1.25 cm，下落打击致伤能量为25 gcf(gram centimeter force)]，启动开关，打击棒自由落下(确保打击棒与脊髓垂直)，致伤后迅速移去打击棒，可见打击处硬脊膜形成血肿，并可见大鼠双下肢痉挛抖动，尾巴痉挛性摆动(此为造模成功的体征)，遂行肌肉和皮肤缝合，消毒、复温后将大鼠放回笼中。造模后，奥希替尼组给予浓度为0.4 mg/mL奥希替尼溶液灌胃(2 mL/d)，假手术组和损伤组给予生理盐水灌胃(2 mL/d)，均干预1周。

1.3 免疫印迹法检测紧密连接蛋白及致炎因子的表达

每组取5只大鼠于致伤后3、7 d快速剥取损伤节段脊髓组织，加入裂解液冰上孵育并彻底匀浆，离心后留取上清，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；全湿式电转法转移到PVDF膜上；5%封闭液(1 g奶粉+20 mL TBST)封闭2 h，分别加入一抗(以GAPDH为内参)，4℃孵育过夜；用TBST溶液洗涤10 min×3次，加入二抗，4℃孵育过夜；TBST洗膜10 min×3次，加ECL发光显示液在暗室中摄像，凝胶成像分析系统进行蛋白表达半定量分析。

1.4 免疫荧光染色

大鼠脊髓损伤后第7天，每组随机取3只大鼠，深度麻醉后自左心室快速灌注生理盐水冲洗，待流出清亮液体后，灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)固定1 h，切取损伤节段长约1.0 cm的脊髓，置于PB液中，固定4 h后，置于含20%蔗糖的PB中4℃过夜。待脊髓组织沉底后取出并进行冰冻切片(切片厚10 μm)。将切片固定于多聚赖氨酸包被的玻片上，以5%山羊血清封闭1 h，分别滴加一抗[兔抗GFAP(1∶100稀释)、鼠抗CD11b(1∶200稀释)]，4℃孵育过夜。PBS洗5 min×3次，分别滴加二抗[羊抗兔Cy3(1∶400稀释)、羊抗鼠Cy3(1∶400稀释)]，37℃作用1 h，PBS洗5 min×3次，甘油封片。荧光显微镜下摄像，彩色病理图文分析系统进行图像分析。

1.5 脊髓组织髓鞘Luxol Fast Blue染色

大鼠脊髓损伤后第14天，每组取3只大鼠，将含损伤部位的各组脊髓组织轴位水平切成20 μm的切片，染色操作过程按Luxol Fast Blue染色试剂盒说明操作。Olympus BX-51光学显微镜下摄像，Image Pro Plus分析软件分析髓鞘脱失面积，以脊髓损伤中心处切片来比较各组髓鞘脱失的面积。

1.6 后肢运动功能评估

由2名经专门培训的研究人员(对分组不知情)应用BBB量表在开放式场地对各组大鼠的运动能力进行评分(术后当天及以后每周1次，每组5只大鼠)。其中BBB量表的评分范围为从0分(弛缓性麻痹)到21分(正常步态)。

1.7 排尿功能评估

SCI后，每日人工按摩膀胱2次，协助大鼠排出残余尿，用小烧杯收集尿液并记录尿量，直到自主膀胱功能恢复。

1.8 统计学方法

用SPSS 22.0、Graphpad Prism 6.01软件进行统计分析和绘图，计量资料用均数±标准差表示，两组均数比较采用独立样本t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，运动功能和残余尿量评估应用重复测量方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 致炎因子的表达

在SCI后3、7 d，损伤组的致炎因子(TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS)表达明显高于假手术组(均P<0.01)，而奥希替尼干预组致炎因子表达量明显低于损伤组(均P<0.05)，见图1。

1：假手术组；2：奥希替尼组；3：损伤组；A：SCI后3、7 d TNF-α，IL-1β，iNOS和COX-2表达的Western blot代表图；B：SCI后3 d致炎因子表达统计图；C：SCI后7 d致炎因子表达统计图。*P<0.05 **P<0.01图1 EGFR抑制剂奥希替尼下调脊髓损伤组织致炎因子的表达Fig.1 The EGFR inhibitor osimertinib down-regulated the expression of inflammatory factors

2.2 紧密连接蛋白表达

SCI后3、7 d，损伤组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达量均明显低于假手术组(均P<0.01)，而奥希替尼组的ZO-1和Occludin表达量均较损伤组明显增加(均P<0.05)，见图2。

1：假手术组；2：奥希替尼组；3：损伤组；A：SCI后3、7 d紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达的Western blot代表图；B：SCI后3 d紧密连接蛋白表达的统计图；C：SCI后7 d紧密连接蛋白表达的统计图。*P<0.05 ** P<0.01图2 EGFR抑制剂奥希替尼减轻SCI后微血管内皮细胞间紧密连接蛋白的脱失Fig.2 The EGFR inhibitor osimertinib alleviated the loss of tight junction proteins in microvascular endothelial cells after SCI

2.3 EGFR磷酸化

SCI后3、7 d损伤组EGFR活化较假手术组明显增加(均P<0.01)，而奥希替尼干预后EGFR活化较损伤组明显减少(均P<0.05)，见图3。

1：假手术组；2：奥希替尼组；3：损伤组；A：SCI后3、7 d各组p-EGFR、EGFR表达的Western blot代表图；B：SCI后3、7 d p-EGFR表达的统计图。*P<0.05 **P<0.01图3 EGFR抑制剂奥希替尼有效抑制损伤脊髓组织中EGFR的活化Fig.3 The EGFR inhibitor osimertinib effectively inhibited EGFR activation

2.4 胶质细胞增生

脊髓损伤后7 d，损伤组GFAP(星形胶质细胞标志物)及CD11b(小胶质细胞标志物)表达明显高于假手术组(均P<0.01)，提示小胶质细胞及星形胶质细胞明显活化、增生(图4)。而奥希替尼组GFAP及CD11b表达明显低于损伤组(均P<0.05)，表明奥希替尼可以有效抑制SCI后胶质细胞增生(图4)。

1：假手术组；2：奥希替尼组；3：损伤组；A：SCI后7 d损伤脊髓组织的免疫荧光染色，标尺=50 μm；B：SCI后7 d各组GFAP、CD11b表达的Western blot代表图；C：SCI后7 d GFAP、CD11b表达统计图。*P<0.05 **P<0.01图4 EGFR抑制剂奥希替尼抑制SCI后胶质细胞增生Fig.4 The EGFR inhibitor osimertinib effectively inhibited gliosis after SCI

2.5 髄鞘脱失

SCI后14 d，假手术组脊髓的髓鞘组织均匀着色，提示髄鞘组织完整；而损伤组中脊髓损伤中心区见大片无着色区域；奥希替尼组脊髓组织损伤区无着色的范围明显缩小(与损伤组比较，P<0.05)，见图5。

A：脊髓组织Luxol Fast Blue染色，标尺=1 mm；B：奥希替尼组和损伤组脊髓组织髓鞘脱失面积比较，*P<0.05图5 EGFR抑制剂奥希替尼抑制SCI后髓鞘脱失Fig.5 The EGFR inhibitor osimertinib inhibited demyelination after SCI

2.6 运动功能及排尿功能评估

SCI后，损伤组和奥希替尼组大鼠BBB评分均接近0分，提示两组损伤程度无差异。而1周后两组运动功能评分均有提高，但奥希替尼组BBB评分增加幅度明显高于损伤组，重复测量方差分析显示：两组评分存在显著差异(P<0.05)。残余尿量分析提示SCI后1 d损伤组和奥希替尼组均出现大量残余尿量(约5 mL/d)，两组差异无统计学意义；而奥希替尼组在SCI后第6天残余尿量开始减少，损伤组残余尿量至SCI后第8天才开始减少，重复测量方差分析显示：奥希替尼组残余尿量明显少于损伤组(P<0.05)，见图6。

A：BBB评分评估SCI后大鼠运动功能；B：各组大鼠SCI后残余尿量变化图6 EGFR抑制剂奥希替尼促进SCI后大鼠神经功能恢复Fig.6 The EGFR inhibitor osimertinib promoted the recovery of motor and urinary function of rats after SCI

3 讨论

脊髓损伤(SCI)在各国均有较高的发病率，SCI后往往会造成严重的神经功能缺损，常常导致不同程度的肢体瘫痪、大小便及性功能障碍，且这些神经功能缺损往往是不可逆的[1]。SCI后神经损伤包括原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤指初始机械暴力作用于脊髓所产生的损伤。继发性损伤指外力造成脊髓损伤后引发的进一步病理损害过程，包括水肿、缺血、凋亡、炎症反应、自由基和脂质过氧化、轴突再生抑制、胶质瘢痕形成等[12]。原发性损伤不可逆转，因此，抑制继发性损伤是干预脊髓损伤的关键[12]。

SCI后机械暴力不仅导致神经组织损伤而且引发血脊髓屏障(BSCB)严重破坏[8]。BSCB的破坏导致血液中的炎症细胞及炎症因子侵入到中枢神经组织。这些炎症细胞及炎症因子可导致神经元和少突胶质细胞损伤并进一步损伤BSCB，同时还可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，导致过度胶质增生，并释放大量致炎因子，如TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2等[13-14]。而这些致炎因子同样会导致神经元和少突胶质细胞损伤，引发反应性神经毒性炎症损伤，导致脊髓继发损伤进一步加重[15]。过度的反应性炎症还可导致非损伤区的BSCB破坏，从而引起新一轮外周炎症细胞和炎症因子侵入脊髓组织，形成脊髓组织炎症损伤的恶性循环(即正反馈损伤)。因此，SCI后BSCB的破坏和反应性炎症损伤在脊髓继发损伤中起着至关重要的作用[16]。

BSCB完整性与微血管内皮细胞间的紧密连接蛋白的表达密切相关。紧密连接相关蛋白的缺失会造成BSCB破坏，从而增加BSCB通透性[7]。而SCI后紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)的脱失与SCI后炎症反应损伤密切相关。研究证明，SCI后致炎因子的表达与紧密连接蛋白表达呈负相关[7]，过度的炎症反应可造成紧密连接蛋白缺失，导致BSCB完整性受损，血管通透性增加，外周炎性物质渗漏入神经组织，激活小胶质细胞和星形胶质细胞，导致反应性胶质增生，引起炎症级联反应[14,17-18]，导致髄鞘脱失和神经元的损伤[19]。已有研究证实，SCI后小胶质细胞和星形胶质细胞过度胶质增生时均出现EGFR的过度活化[9,14]。因此，抑制胶质细胞的EGFR过度活化，可阻断SCI的炎症级联反应[18]，从而减轻炎症造成的神经毒性反应。

本实验中，损伤组致炎因子(IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS)明显增高，而紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)明显降低，星形胶质细胞和小胶质细胞过度活化增生，脊髓组织出现大量髄鞘脱失，大鼠出现明显神经功能缺损，这提示SCI后炎症级联反应造成明显神经损伤。而应用奥希替尼干预后，紧密连接蛋白表达较损伤组明显增加，而致炎因子表达较损伤组明显减少，胶质细胞活化增生得到抑制，并最终促进了大鼠神经功能的恢复。这些结果表明奥希替尼可通过抑制EGFR活化，降低致炎因子表达，减少紧密连接蛋白缺失，抑制胶质细胞活化增生，从而减轻SCI后的炎症级联反应，并最终缓解了髄鞘脱失和促进了大鼠神经功能恢复。

综上所述，大鼠SCI后BSCB遭到破坏，导致外周血液中的各种炎性物质渗出至脊髓神经组织，引起反应性炎症损伤而加重脊髓继发性损伤。EGFR抑制剂奥希替尼通过抑制EGFR活化，降低致炎因子表达，减少紧密连接蛋白缺失，抑制血脊髓屏障破坏，抑制胶质细胞活化增生，减轻炎症级联反应，缓解了髄鞘脱失和促进运动功能恢复。