四鲜汤鲜药汁对急性粒 -单核白血病细胞WEHI-3小鼠模型的影响

张 瑾，康 乐，李秀敏，苗明三

（1.河南中医药大学 药学院，郑州 450000；2.纽约医学院 微生物和免疫学科，纽约 10595）

急性粒 单核细胞白血病是一种由于粒细胞和单核细胞两系同时发生恶性增生的急性白血病。在临床中约占急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）发病人数的15%［1］，具有缓解率低、易复发的特点［2］。AML在中医学中属于“热劳”“温病”“血证”“痰核”“瘰疬”“癥瘕”“积聚”“虚劳”等范畴，在治疗中应以清热解毒为根本［3］。

四鲜汤是由鲜生地、鲜小蓟、鲜蒲公英、鲜白茅根4味药组成，具有养阴清热、凉血解毒、宁络止血之功。在服用时，将鲜药洗净切碎，直接取汁饮用，可以治疗由阴虚内热引起的各种血液病和出血性疾病［4］。

本实验主要以四鲜汤鲜药汁为研究对象，采用急性粒单核白血病细胞（WEHI-3细胞）制备AML小鼠模型，观察四鲜汤鲜药汁对AML动物模型的影响，并探讨其抑制作用，为四鲜汤鲜药应用于治疗白血病提供了理论及实验基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

雄性BALB／c小鼠，18～21 g，购自山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20190003，动物合格证号：1107261911002008，实验前小鼠适应环境至少1周。将小鼠（每组12只）置于塑料笼中，12 h光－照循环（23℃，（55±5）%湿度）下，自由饮水。所有涉及动物的实验程序均经河南中医药大学伦理委员会批准，实验动物使用许可证号：SYXK（豫）2015－0005。

1.2 实验药品

四鲜汤：鲜地黄150 g，鲜蒲公英、鲜小蓟、鲜白茅根各300 g；将以上4味药称重，除去杂质，洗净，将其切成3～5 mm的片或段，用榨汁机榨取鲜药汁后再次称重，计算鲜药比例折算用量，得四鲜汤鲜药汁（本实验所采用的鲜地黄1 g相当于鲜地黄汁1.14 mL；鲜蒲公英1 g相当于鲜蒲公英汁1.83 mL；鲜小蓟1 g相当于鲜小蓟汁1.60 mL；鲜白茅根1 g相当于鲜白茅根汁2.98 mL），即鲜地黄汁171.06 mL、鲜蒲公英汁547.68 mL、鲜小蓟汁481 mL、鲜白茅根汁895.8 mL。消癌平片（阳性对照药），购于长春银诺克药业有限公司，批号：20190801。

1.3 实验试剂与仪器

DMEM高糖培养基，北京索莱宝科技有限公司，批号：20191011；Lonsera南美胎牛血清，上海双洳（思洳）生物科技有限公司，批号：OH12343；青链霉素混合液，北京索莱宝科技有限公司，批号：20190712；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，北京索莱宝科技有限公司，批号：20190506；Hyclone磷酸盐缓冲溶液（PBS）批号：AE29042298；FITC anti-mouse CD3抗体，美国BioLegend公司，批号：B291431；PEanti-mouse CD19抗体，美国BioLegend公司，批号：B288652；PE anti-mouse／human CD11b抗体，美国BioLegend公司，批号：B294977；FITC anti-mouseCD107b（Mac-3），美国BD BIOSCIENCES PHARMINGEN公司，批号：9050953；小鼠白细胞介素2（IL-2）ELISA检测试剂盒，苏州卡尔文有限公司，批号：E20200501A；小鼠白细胞介素3（IL-3）ELISA检测试剂盒，苏州卡尔文有限公司，批号：E20200501；小鼠干扰素γ（IFN-γ）ELISA检测试剂盒，苏州卡尔文有限公司，批号：E20200501；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒，苏州卡尔文有限公司，批号：2411639601。

BIO-RAD680酶标仪（美国BIO-RAD公司）；Forma 371 CO2细胞培养箱，美国ThermoFisher Scientific公司；CytoFLEX流式细胞仪，美国Beckman公司；Coutstar细胞分析仪，上海睿钰生物科技有限公司；BX63-CellSens全电动智能显微镜，日本Olympus公司；H2050R台式高速大容量冷冻离心机（湖南湘仪开发有限公司）；DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱（上海－恒科学仪器有限公司）；Wellwash Versa双排全自动洗板机，美国ThermoFisher Scientific公司。

1.4 白血病细胞株和细胞培养

WEHI-3小鼠白血病细胞，购于Otwo Biotech（ShenZhen），货号：HTX2665。细胞用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基，在5%饱和湿度的无菌恒温培养箱培养，隔天传代1次。

2 实验过程

1）模型制备

体外培养WEHI-3细胞，待细胞进入对数生长期后进行扩增，收集细胞后以PBS重悬并计数，调整细胞密度至5×106个／mL，取60只BALB／c小鼠，雄性，SPF级，8～10周龄，体重20～22 g，每只小鼠腹腔注射0.2 mL细胞悬液，即每只小鼠接种1×106个WEHI-3细胞。

2）给药方法

随机分为5组，即：模型组（WEHI-3）、阳性对照组（消癌平，2.25 g／kg，0.1 mL／10 g）、四鲜汤汁低剂量组（24.5 g／kg，相当于临床剂量的7.5倍，0.4 mL／10g）、四鲜汤汁中剂量组（49 g／kg，相当于临床剂量的15倍，0.4 mL／10g）、四鲜汤汁高剂量组（98 g／kg，相当于临床剂量的30倍，0.4 mL／10 g），每组12只，先接种白血病细胞，接种10 d后各组灌胃相应药物。另设12只空白对照组，同模型组每日给予等量溶媒，0.2 mL／只，每日1次，连续14 d。

3 指标检测

1）表观指标观察

给药期间每日观察各组小鼠的一般精神状态、进食情况、体重等方面的变化。

2）细胞因子检测

末次给药1 h后，小鼠眼眶取血，4℃离心（3 500 rpm）10 min，收集上清，用细胞因子酶联免疫检测试剂盒检测样本中的白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-3（Interleukin-3，IL-3）、γ干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。具体方法按试剂盒说明进行。450 nm波长处读取光密度值。各细胞因子浓度参照已知浓度标准品绘制的标准曲线判定。

3）白细胞表面标记物检测

末次给药后，对所有小鼠进行称重，眼眶抗凝取血，与肝素混匀后置于室温，取抗凝全血100 μL，每管加入室温红细胞裂解液4 mL，充分混匀，室温静置3 min。1 000 rpm离心5 min，弃上清。用PBS洗涤2次，每次4 mL，1 000 rpm离心5 min，弃上清。用100μL PBS重悬细胞，加入荧光标记抗体，混匀，4℃避光孵育40 min。每组分别设置空白和单标。用PBS洗涤2次，每次4 mL，1 000 rpm离心5 min，弃上清。用200μL PBS重悬细胞，4℃避光放置，2 h内流式细胞仪检测细胞标志物百分率。

4）脾脏病理观察

各组小鼠处死后，取出小鼠的脾脏，4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后进行H＆E染色，在光镜下观察其病理学变化。

5）统计学处理

用SPSS21.0 for windows对数据加以分析，实验结果以平均值±标准差（±s）的形式表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差不齐者用Games-Howell法，齐者用LSD法，等级资料采用Ridit检验。

4 结果

4.1 各组小鼠体质量情况

空白组小鼠体重平稳增长，毛发正常，精神良好，行为活跃。与空白组比，模型组小鼠随着造模时间增加，体重有明显增加的趋势（P＜0.05或P＜0.01），可能是由于腹腔形成肿瘤和腹水的原因：表现为弓背蜷缩、聚团、皮毛枯萎、精神萎靡、活动减少等体征。与模型组比较，各给药组小鼠弓背蜷缩、聚团、皮毛枯萎、精神萎靡、活动减少等体征均有改善；给药第5 d，与模型组相比，四鲜汤汁中剂量组小鼠体重明显下降（P＜0.05）；给药第9 d，与模型组相比，消癌平组、四鲜汤汁中剂量组小鼠体重明显下降（P＜0.05）；给药第14 d，与模型组相比较，四鲜汤汁中剂量组小鼠体重显著下降（P＜0.01），消癌平组小鼠体重明显下降（P＜0.05），见图1。

图1 各组小鼠体质量情况折线图（±s，n＝12）

4.2 各组小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-α的含量

图2为各组小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNFα的含量。

图2 各组小鼠血清IL-2、IL-3、TNF-α和IFN-γ的含量（±s，n＝12）示意图与空白组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05，；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

由图2可知：与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-2显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，消癌平和四鲜汤汁各剂量可显著升高小鼠血清中IL-2的水平（P＜0.01）。与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-3显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，四鲜汤汁低剂量组可明显升高小鼠血清中IL-3水平（P＜0.05），四鲜汤汁各剂量均能够不同程度升高小鼠血清中IL-3的水平。与空白组相比，模型组小鼠血清中TNF-α有所降低；与模型组相比，四鲜汤汁低、中剂量组可显著升高小鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.01）；四鲜汤汁高剂量组也可明显升高小鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.05）。与空白组相比，模型组小鼠血清中IFN-γ显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，四鲜汤汁中、高剂量可显著升高小鼠血清中IFN-γ的水平（P＜0.01）；四鲜汤汁低剂量组也可明显升高小鼠血清中IFN-γ的水平（P＜0.05）。

4.3 各组小鼠白细胞表面标志水平

本研究通过CD11b分子、Mac-3分子、CD3和CD19检测各组小鼠白细胞表面标志水平（图3）。模型组小鼠的CD11b水平明显升高（P＜0.05），与模型组相比，消癌平组和四鲜汤汁各剂量组的CD11b均有下降趋势，其中四鲜汤汁低剂量较之模型组明显下降（P＜0.05），四鲜汤汁中、高剂量的CD11b水平显著下降（P＜0.01）。模型组小鼠Mac-3水平显著升高（P＜0.01），四鲜汤汁低剂量的Mac-3水平较之模型组明显下降（P＜0.05），消癌平组、四鲜汤汁中、高剂量的Mac-3水平显著下降（P＜0.01）。此外，与模型组相比，消癌平组和四鲜汤汁各给药组小鼠的CD3和CD19的水平均比模型组升高，与空白组相比，模型组小鼠CD3的比率均显著降低（P＜0.01），其中消癌平组和四鲜汤汁低剂量的CD3比率明显升高（P＜0.05），四鲜汤汁中、高剂量组则显著升高（P＜0.01）。模型组小鼠CD19的比率显著降低（P＜0.01）。四鲜汤汁低剂量组的CD19比率明显升高（P＜0.05），消癌平组、四鲜汤汁中、高剂量组的CD19也有升高趋势。

图3 白细胞表面分子标志（±s，n＝12）直方图与空白组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05，；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

4.4 脾脏病检

图4为各组小鼠脾脏病理变化情况，由图4可知，空白组小鼠脾脏正常，结构完整，红白髓间界限清楚，脾小体结构清晰。模型组小鼠脾脏红白髓间界限模糊，脾脏的淋巴细胞减少。消癌平组脾脏的淋巴细胞较模型组多。四鲜汤鲜药汁的低、中、高剂量组脾脏正常，脾小体结构清晰，组织结构完整，淋巴细胞较模型组多，提示细胞的免疫功能增强。

图4 各组小鼠脾脏病理图

5 结果与讨论

急性髓系白血病是最常见的急性白血病，多数病例发病迅猛，预后较差。目前主要治疗方案为化疗和造血干细胞移植，但经常会出现化疗效果不理想、毒副作用较大、容易复发等情况［5］。目前AML的发病机制尚未完全清楚，现有研究表明其诱因有物理、化学、生物及遗传因素等。免疫功能异常也会增加发生AML的风险［6－7］。

鲜药具有活性成分含量高、疗效好的特点［8］。在临床上最常见的应用鲜药的方法是自然汁服用，这种方式能保持药物天然的活性成分［9］，适用于急危重症、外感热病、邪热炽盛或化火伤阴等病症的治疗。现代中医学认为急性髓系白血病是由于正气虚损与邪毒内侵并举，正邪相争，久病则虚，毒在骨髓、气血津液传变，致使脏腑气血功能受损失调，气血亏耗，内虚为本，病情反复。治疗原则应以本虚标实为根本，或邪盛正虚、正虚邪伏、正胜邪退［10］。四鲜汤中鲜生地在生理活性上对中枢神经系统、心脑血管系统、免疫系统等有明显的作用，并具有抗骨质疏松、抗炎等药理作用［11］；鲜小蓟的药理作用包括止血凝血、抗菌抗炎、抗癌等［12］；鲜蒲公英在抗炎、抗肿瘤、抑菌、抗病毒、抗氧化、胃肠保护、利尿等方面有显著的药理活性［13］；鲜白茅根具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、止血、调节脂质代谢等药理作用［14］。中医药治疗急性白血病具有一定的特色和优势，目前已有研究证实四鲜汤治疗急性白血病具有良好疗效［15］。

本实验结果表明：四鲜汤鲜药汁可改善模型小鼠的活动情况，不同程度的升高小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-α的含量，其中IL-2属于Th1细胞因子，具有增强Th1免疫反应的能力，介导激活CD8＋CTL细胞，产生致炎性细胞因子，增强NK细胞活性，从而发挥抗细菌、抗病毒和抗肿瘤的作用［16－17］；IL-3由受到抗原刺激而被活化的辅助T细胞产生，是反应产生的炎症性细胞因子，具有造血和免疫调节的作用［18－19］；IFN-γ具有较强的抗肿瘤免疫调节功能，治疗后的小鼠IFN-γ升高说明了四鲜汤鲜药汁可以提高免疫功能，激活机体的免疫状态［20－21］；TNF-α具有抗肿瘤作用，是重要的免疫调节因子，与机体的炎症、免疫反应有密切关系［22－23］，证明了四鲜汤鲜药汁可以调节免疫功能，刺激细胞发挥抗肿瘤作用。四鲜汤鲜药汁治疗组降低了CD11b和Mac-3的水平，升高CD3和CD19的水平。CD11b在正常情况下，主要在成熟单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞上表达，其主要功能是促进炎症的发生和发展，促进吞噬细胞的吞噬功能等，在机体的抗感染免疫中发挥重要作用［24］。CD3是成熟T淋巴细胞，表示人体细胞免疫功能状态，其水平升高表示了机体识别和杀伤肿瘤细胞的能力上升［25］。CD19参与B细胞的增殖、分化、活化及抗体产生，可以促进BCR的信号转导［26］，这些结果证明了四鲜汤鲜药汁提高了T、B细胞的增殖能力，从而抑制了单核细胞和巨噬细胞的增殖［27］，增强了机体的抗肿瘤能力。并且四鲜汤鲜药汁能明显改善脾脏的病理变化，并未造成机体的肝损伤。

本实验证明了四鲜汤鲜药汁对AML有较好的治疗作用，为鲜药在现代应用中的进一步发展提供了实验基础。