两种基因多态性与退行性腰椎管狭窄症的关联性分析

张彦军 郭铁峰△ 杜凯然 刘晓雪 罗林钊 李佳明

腰椎间盘退变性疾病是指由腰椎间盘退变引起的以腰腿疼痛、麻木及无力为主的临床症候群[1]。随着遗传学及分子生物学研究的进展，已经陆续发现并提取与腰椎退行性病变相关的特异性基因。目前研究证实主要有COL11A1、COL11A2、COL9A2、HOXB4、BMPRⅡ、Collagen等基因与退行性腰椎管狭窄症有相关性[2-3]。本院通过大量的临床观察研究，发现腰椎管狭窄症患者中医证型多集中在肝肾亏虚型，故推测肝肾亏虚型腰椎管狭窄与基因多态性存在一定的关联，从而利用中药调控其基因，获得基因的治疗靶点，提高中医药治疗相关疾病的临床疗效。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

应用临床流行病学调查法，随机抽取甘肃省中医院脊柱骨二科2016年6月至2018年6月门诊和住院治疗的退行性腰椎管狭窄症患者80例为病例组，以来自甘肃省中医院脊柱骨二科门诊的80例非腰椎退行性疾患患者为对照组，与病例组匹配。对照组在年龄、性别、年龄、体质量指数、劳动强度与病例组相匹配。所有患者影像学资料完整。

1.2 诊断标准

腰椎管狭窄症诊断标准如下：

1)慢性腰痛史，部分病人有外伤史。

2)多发生于60岁以上的体力劳动者。

3)长期反复的腰腿痛和间歇性跛行，腰痛在前屈时减轻，在后伸时加重，腿痛多为双侧，可交替出现，站立和行走时出现腰腿痛或麻木无力，疼痛和跛行逐渐加重，体息后好转。严重者可引起尿频或排尿困难[4]。

4)下肢肌萎缩，腱反射减弱，腰过伸试验阳性，直腿抬高试验阳性。

5)腰部 X 线、CT、MRI 检查见脊柱生理弧度改变，椎间隙变窄，椎体后缘骨质增生，后纵韧带钙化，小关节肥大或密度增高，椎弓根肥大、内聚，假性椎体滑移。

1.3 中医证候判定标准

依据《中医诊断学》制定“COL11A1基因多态性与退行性腰椎管狭窄症的多态性研究”调查表，中医证型包括风寒痹阻型、肝肾亏虚型、气虚血瘀型[5]。

1.4 纳入标准

1)与上述诊断标准相符；

2)年龄在40～70岁之间；

3)患者知情同意，自愿参加本次调查。

1.5 排除标准

1)不符合上述诊断标准者；

2)合并冠心病、糖尿病、高血压病等重大内科疾病，或患有严重的造血系统疾病、精神病等患者；

3)腰椎有结核、肿瘤、骨折、脱位、严重骨质疏松、感染、畸形等。

1.6 病例收集

对于调查者进行为期1周的相关标准培训，所有纳入及排除人群均由培训人员进行统一的数据统计。在此基础上，嘱患者空腹10 h后，抽取外周血2 mL作为检测样本，然后注入含肝素抗凝剂的真空管中混匀，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.7 实验材料

参考 NCBI等人类基因组SNP库，用Primer Premier 5.0软件设计9个基因的11个多态性SNP位点的PCR引物序列。检测指标包括COL11A1、HBOX4基因的2个位点，即rs14637185和rs520540位点，引物由甘肃生物制剂公司合成[6]。

1.8 试验方法

1.8.1DNA的提取 抽取外周静脉血抗凝离心后，常规QIAampDNABloodMini试剂盒提取DNA。

1.8.2PCR扩增 COL11A1引物(正向5′-GACTAT-CCCCTCTTCAGAACTGTTAAC-3′；反向5′-CTTCTAT-CAAGTGGTTTCGTGGTTT-3′)[7]；HBOX4引物(5′-AC-TACAATCGCTACCTGACGC-3′；反向5′-TTGGGCAA-CTTGTGGTCTT-3′)。PCR反应体系：Premix ExTaq 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 4 μL，灭菌三蒸水17 μL，总体积50 μL。初始变性为5 min/95 ℃[8]；6个接地时间分别是30 s/95 ℃，45 s/62 ℃或64 ℃(初始退火温度)，每个周期降低1 ℃，并降低45 s/72 ℃；另外30个周期分别是30 s/95 ℃，45 s/56 ℃或58 ℃(最终目标退火温度)和45 s/72 ℃；最后延长7 min/72 ℃。然后使用核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶(GE Healthcare，Piscataway，美国新泽西州)纯化PCR产物[9]，所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.8.3PCR扩增产物酶切 COL11A1基因6p21.3位点PCR扩增产物在37 ℃温水放置30 min。COL11A1基因6q21.3位点酶切产物：将配置完成的1.5%琼脂糖凝胶和5 μL DL500 DNA 标记物分别加入样品槽中，标记号为1。取10×QuickCut Green Buffer直接进行电泳检测，另取5 μL酶切产物依次加入琼脂凝胶板的其他样品槽中，用1×TEB缓冲液进行稀释。而后设定125 V，电流保持在80 mA以上进行电泳分离。当溴酚蓝条带距离前沿2 cm，5 μL DL500 DNA 标记物条带分散则可停止电泳，用拍照系统拍照观察。COL11A1基因6p21.3位点G被T取代，形成GT、GG、TT 3种等位基因。用同上方法HBOX4基因17q21位点T被C取代，形成TT、CT、CC 3种等位基因。

1.9 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。用χ2检验分析各基因型及等位基因分布差异，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

纳入研究的患者共80例，签署知情同意书，其中对照组年龄40～70岁，中位数58岁；病程6～22个月，中位数15个月；病例组年龄40～70岁，中位数59岁；病程7～26个月，中位数14个月。两组患者的一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。疾病分型：病例组与对照组分别分为风寒痹阻型、肝肾亏虚型、气虚血瘀型。两组数据经χ2检验，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，证实腰椎管狭窄症患者与肝肾阴虚型患者具有一定相关性。

表1 腰椎管狭窄症与非腰椎管狭窄症患者性别、年龄、体质量指数比较

表2 腰椎管狭窄症与非腰椎管狭窄症三种中医证型比较(例)

2.2 两组患者COL11A1基因多态性比较

选择COL11A1基因位点rs14637185基因型频率和等位基因型频率，在两组患者中差异有统计学意义(P<0.05)，见表3，提示COL11A1基因多态性与腰椎管狭窄的患病率存在一定的关联性。

表3 对照组与病例组6p21.3 C/G基因型和等位基因频率比较[例(%)]

将病例组COL11A1基因与6p21.3 GG、CG、C、G基因频率肝肾亏虚型、非肝肾亏虚型与对照组进行比较，其中肝肾亏虚型、非肝肾亏虚型与对照组的COL11A1各基因型差异有统计学意义(P<0.05)，见表4；肝肾亏虚型、非肝肾亏虚型和对照组等位基因差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 COL11A1基因与6p21.3 GG、CG、C、G基因频率在腰椎管狭窄证中不同证候的分布[例(%)]

将病例组HBOX4位于17q21的rs520540位点TT、CT、CC 3种基因型与对照组进行比较(P<0.05)见表5，病例组C、T 2种等位基因与对照组比较(P<0.05)见表5。将病例组HBOX4基因与17q21的rs520540位点GG、CG、C、G基因频率肝肾亏虚型、非肝肾亏虚型与对照组进行比较，其中肝肾亏虚型、非肝肾亏虚型与对照组的HBOX4各基因型差异有统计学意义(P<0.05)，见表6；肝肾亏虚型、非肝肾亏虚型与对照组等位基因差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表5 对照组与病例组HBOX4位于17q21的rs520540位点TT、CT、CC、C、T基因型和等位基因频率比较[例(%)]

表6 HBOX4基因与17q21的rs520540位点GG、CG、C、G基因频率在腰椎管狭窄症中不同证候的分布[例(%)]

3 讨论

腰椎管狭窄症最常见的类型是由脊柱并发疾病，例如小关节骨关节炎和椎间盘退变疾病引起的，高发人群主要集中在50～70岁年龄段，男性多于女性。Deer等[10]发现腰椎管狭窄症患者有95%出现腰痛、背痛和坐骨神经痛，并出现间歇性神经源性跛行，也称为假性跛行，即患者行走一段时间后双下肢疼痛比腰背部疼痛更为严重，但休息后疼痛可迅速缓解。91%的人群出现双下肢痿软、无力，生活不便，甚至会出现截瘫及大小便失禁等情况[10-12]。目前，多数研究者认为退行性腰椎管狭窄症为复杂疾病，又称为多因子病，其遗传模式属于多基因效应。遗传因素可能通过多种机制影响椎间盘退变，如影响脊柱结构的大小和形态，进而影响脊柱的力学结构，导致对外力作用的不耐受等。为分析基因变异及多态性对退行性腰椎管狭窄症的影响，大量研究关注于对脊柱稳定性具有重要作用的结构软骨蛋白编码基因。现已发现有聚集蛋白聚糖的突变及功能多态性，维生素D受体和胶原蛋白基因影响Ⅸ型胶原蛋白合成。实验研究显示在动物模型中Ⅸ型及Ⅱ型胶原蛋白改变与临床表型具有关联性。近期的研究主要集中在Ⅸ型胶原蛋白编码在a2及a3链上的胶原蛋白基因COL9A2和COL9A3。1999年Annunen首次对COL9A2等位基因突变体与椎间盘退变疾患的关联性进行研究，并证实COL9A2基因突变是导致椎间盘退变的重要因素，COL9A2基因Trp2突变占腰椎退行性疾患的芬兰人群的3.8%，而正常组未见有此等位基因。这一结果同样得到Wu等[13]的证实[13]，他们发现在有临床症状及放射学表现的腰椎退行性疾患的患者中等位基因对比遗传模型下，COL9A2与亚洲人群的腰椎退行性疾患风险相关。Higashino等[14]观察到COL9A2基因Trp2等位基因发生率在芬兰人群中相对较高，并且进一步探讨基因突变对疾病临床表型的影响，发现在控制组中有很高的自由性。除此之外，Wang等[15]通过转基因大鼠模型研究，显示Ⅸ型胶原蛋白的缺失将导致椎间盘的退变及椎间盘突出。

胶原蛋白(Collagen)为人和哺乳动物体内含量最为丰富的蛋白质(占人体蛋白质总量的25%)，是细胞外基质中最重要的纤维蛋白。已有不少研究发现，胶原蛋白家族基因与退行性腰椎管狭窄症发病可能有关联性。胶原11A2(COL11A2)基因定位于6p21.3，表达于软骨中。在某些退行性腰椎管狭窄症术后样本的组化分析中，曾发现COL11A2过表达。Koga等研究了53个日本退行性腰椎管狭窄症家系的124例患病同胞对(affected sib-pair)和212例健康对照个体，发现COL11A2基因的4个SNP：启动子第-182位的A>C，第6内含子第636位的T>A，第43外显子的A>G，第46外显子的C>T，均与退行性腰椎管狭窄症强烈关联。有研究者研究了COL11A2 第43外显子的A>G与第46外显子的C>T两个SNP位点rs712702754和rs377233986。2003年，Tanaka等分析了70个日本退行性腰椎管狭窄症家系的142例患病同胞对和298例健康对照个体，发现3个与退行性腰椎管狭窄症发病相关的SNP：第2 内含子的+18、第32内含子的-29以及第33内含子的+20。COL6A1基因多态性可能有增加骨量的功能。COL6A1第21内含子的+18(rs143695871)是本研究进行检测的SNP位点之一，并未发现与退行性腰椎管狭窄症有显著的关联性。通过之前研究发现关于COL11A1基因与6p21.3的rs14637185，发现C等位基因与腰椎管狭窄症存在一定的相关性，由此可表明C的等位基因导致腰椎间盘突出症的风险因素更高[16-17]。以上分析可推理COL11A1的位点6p21.3 rs14637185与腰椎管狭窄症存在一定的相关性。

本研究结果显示COL11A1基因与6p21.3 G/T位点多态性与腰椎管狭窄症之间存在一定关联性。本研究选取了COL11A1的一个SNP位点rs14637185，发现腰椎管狭窄患者的COL11A1基因型频率和等位基因型频率均高于非腰椎疾患的患者，但从中继续深入研究发现COL11A1基因的多态性与肝肾亏虚型腰椎管狭窄症患者均有明显的相关性。由此则可证明腰椎椎管狭窄症患者犯病率高有可能与COL11A1基因GG、GT、TT等位基因多态性有密切关系，可推测出药物抑制其细胞内的基因(如COL11A1等类似基因)，可延缓甚至治疗腰椎管狭窄症患者，以避免手术，从而减轻患者的痛苦及经济负担。又根据研究证实HBOX4基因的表达可防治腰椎退行性病变，本次实验对HBOX4基因17q21的rs520540位点等位基因频率和基因型频率进行检测，再次证实其具有一定相关性。通过研究发现HBOX4等位基因C、T基因表达频率高低与患有腰椎管狭窄症的概率存在一定的相关性，则患有腰椎管狭窄症患者HBOX4等位基因C、T的表达量低于非腰椎管狭窄症患者。对COL11A1、HBOX4两种基因分别观察其与肝肾亏虚型之间的关系，发现肝肾亏虚型与两种基因的表达量均存在相关性。由此可推测运用补肝肾、强筋骨的中药，可通过调控两种基因的表达频率，一定程度上可防治腰椎管狭窄症。目前本团队根据此实验结果，针对肝肾亏虚型腰椎管狭窄症患者研制相关院内制剂，以期望对防治腰椎管狭窄症有一定临床疗效，切实发挥中医药独特优势。

有研究证实有2个可能的新脊柱退行性疾病易感基因PTCH1和COL17A1[18]，2006年Seppane 等报道COL17A1蛋白存在于人的大脑神经元中，可能涉及各种影响神经元的迁移或突触可塑性疾病[19]。2007年Murrell等发现COL17A1 突变杂合子有牙釉质缺乏，提示COL17A1蛋白合成量降低或发生突变的蛋白虽然可以维持真皮-表皮的稳定性，但会引起牙齿发育的异常[20]。COL6A1基因多态性可能与胸椎后纵韧带骨化的发病有关[21]。随着科研水平的提高，基因研究也在不断深入，本团队将继续围绕胶原蛋白家族，探索其与腰椎管狭窄症等骨科常见病间的关联性，扩充病例数，增加样本量，深入剖析其分子生物学机制，寻找治疗相关疾病的新靶点，从而服务于临床，应用于临床，切实为患者减轻痛苦。