健腰密骨片延缓OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的研究

薛纯纯 王拥军 梁倩倩 施杞 李晓锋△

骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)在骨代谢调控过程中具有重要的作用[1]，全身性OPG基因敲除小鼠(OPG-/-小鼠)出现严重的骨质疏松表型[2]，因此后续的研究以该模式动物为研究对象，主要聚焦于以骨质疏松为主的骨代谢疾病中[3-5]，关于软骨退行性疾病(如椎间盘退变)的研究较少。

多种细胞表达和分泌OPG，软骨细胞和纤维环细胞同样表达OPG[6]，笔者发现OPG-/-小鼠随着增龄椎间盘退变逐渐加重，软骨终板部分骨化[7]，炎性因子表达，新生血管形成[8]。健腰密骨片是上海市名中医施杞教授治疗骨质疏松症的经验方，原发骨质疏松症和椎间盘退变均属于骨或/和关节的退行性疾病，基于中医“肾主骨”和异病同治原则，采用健腰密骨片早期干预OPG-/-小鼠，观察该方是否具有延缓OPG-/-小鼠椎间盘退变的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级10周龄雄性OPG-/-小鼠和WT小鼠购自上海南方模式生物中心(合格证号：SCXK(沪)2005-0002)，其中OPG-/-小鼠20只，WT小鼠10只，饲养在SPF级动物房，自由进食及饮水。适应性饲养2周后，30只小鼠随机分为3组，分别为WT、OPG-/-、健腰密骨片组，每组各10只。

1.2 主要试剂

免疫组化试剂盒(美国Invitrogen公司)，Trizol(美国Sigma公司)，逆转录试剂盒和荧光定量试剂(大连宝生物工程有限公司)，蛋白酶K(德国Merck公司)，多克隆兔抗I型胶原抗体(美国Abcam公司)，多克隆兔抗Ⅱ型和Ⅹ型胶原抗体(美国Sata Cruz Biotechnology公司)，甲苯胺蓝染液、苏木素染液(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 主要仪器

离心机(德国Eppendorf公司，5417R)，组织脱水机(德国LEICA公司，TP1020)，轮转式切片(德国LEICA公司，RM2135)，光学显微镜(日本Olympus，BH-20)，紫外分光光度计(美国Beckman公司，DU 800)，荧光定量PCR仪器(美国BIO-RED公司，CFX96)。

1.4 药物制备及给药方法

由于OPG-/-小鼠为转基因小鼠，耐受性较差，本实验给药周期共3个月，周期较长，故采用含药饲料给药。

健腰密骨片由上海中医药大学附属龙华医院药剂科提供(炙黄芪15 g，川芎12 g，丹参9 g，秦艽12 g，蛇床子15 g，女贞子12 g，淫羊藿12 g)。含药饲料按照文献[9]制备，按照小鼠与人的体型系数换算等效剂量，每只小鼠按5 g/d计算，共10只，90 d共需4 500 g，考虑动物进食中的损耗，按5 000 g饲料制作。中药共4付煎成水煎剂，浓缩至500 mL，加入到5 000 g饲料中，做成含药饲料。动物2～3只/笼，每2 d添加1次含药饲料，持续90 d。

1.5 观察指标及检测方法

给药结束后，获得各组小鼠颈椎，其中各组5只固定进行组织学检测，5只放于液氮固定以备后续RNA提取。组织学检测的标本在中性固定液24 h后，PBS清洗5 min×3次，10%EDTA进行脱钙，每3 d更换1次脱钙液，脱钙4周。标本脱水及石蜡包埋。冠状位连续切片，厚度为7 μm，以椎间盘髓核最大时为中央部位的标准，取前后连续切片进行组织学检测。所有组织染色及RNA抽提取颈5-6椎间盘，用于RNA检测的标本采用Trizol法提取，方法具体如下。

1)甲苯胺蓝染色：组织常规脱蜡复水，甲苯胺蓝染液15 s，蒸馏水洗，常规脱水透明及封片。2)免疫组化染色方法：组织常规脱蜡复水，3% H2O2孵育10 min，PBS浸洗2 min×3次，蛋白酶K进行抗原修复15 min，PBS浸洗5 min×3次，滴入5%BSA封闭1 h。吸走BSA直分别滴加兔多克隆抗Ⅹ、Ⅱ、I型胶原一抗，4 ℃过夜。PBS浸洗5 min×3次，加入二抗，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗5 min×3次，抗生物蛋白链菌素-HRP，37 ℃孵育10 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB显色，苏木精染色2 min，盐酸乙醇分化5 s，氨水返蓝，脱水透明及封片。其中棕黄色着色为阳性表达。3)实时荧光定量RT-PCR方法：将椎间盘组织放入研钵中，按照Trizol法[9]提取RNA，随后按照Takara 逆转录试剂盒说明书进行RNA的逆转录，反转录1 μg，体系为20 μL，条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，结束后加入80 μL ddH2O将逆转录的DNA进行稀释。取各组样品cDNA 2 μL，按照荧光定量PCR试剂说明配置20 μL反应体系进行qPCR，β-actin作为内参。条件为95 ℃ 5 min预变性，进入循环，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，进入延伸，72 ℃ 30 s，4 ℃ 保持。程序结束后进行数值的计算与分析，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 甲苯胺蓝染色

与WT小鼠比较，OPG-/-小鼠椎间盘软骨终板中出现部分缺损，缺损的部位被病理性新骨所代替；与OPG-/-小鼠相比，健腰密骨片组椎间盘软骨终板中的缺损和异位骨化明显减轻，见图1。

图1 各组椎间盘甲苯胺蓝染色(×100)

2.2 椎间盘中Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原的表达

与WT小鼠比较，OPG-/-小鼠椎间盘Ⅱ型胶原表达明显减少，Ⅰ型胶原和Ⅹ型胶原表达增加；与OPG-/-小鼠相比，健腰密骨片组的Ⅱ型胶原蛋白表达增加，Ⅰ型胶原和Ⅹ型胶原蛋白表达降低，见图2。

图2 各组椎间盘软骨终板Ⅱ、Ⅹ、Ⅰ型胶原蛋白的表达(×400)

2.3 椎间盘组织中Aggrecan及Col10α1的表达

与WT小鼠比较，OPG-/-小鼠椎间盘中Aggrecan的水平明显下调，差异有统计学意义(P<0.01)，反之，Col10α1表达明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与OPG-/-组相比，健腰密骨片上调OPG-/-小鼠椎间盘组织 Aggrecan的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)；下调Col10α1表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 各组椎间盘组织中Aggrecan 和Col10α1 mRNA表达

3 讨论

健腰密骨片是上海市名中医施杞教授治疗骨质疏松症的经验方，由炙黄芪、川芎、秦艽、丹参、淫羊藿、补骨脂、蛇床子7味中药组成。诸药配伍，共奏补肾填精、强筋壮骨、益气化瘀之效。课题组前期实验研究证明该方明显提高小鼠椎体骨量，促进骨髓间充质干细胞向成骨分化，促进骨形成[10]。原发骨质疏松症和椎间盘退变性疾病的主要中医病机为肾虚，基于中医“肾主骨”理论和“异病同治”的原则，OPG-/-小鼠出现的椎间盘退变同样可以补肾论治。因此笔者采用健腰密骨片来治疗OPG-/-小鼠出现的椎间盘退变，观察该方是否可以代偿OPG延缓OPG-/-小鼠的椎间盘退变，结果显示与WT组相比，甲苯胺蓝染色发现OPG-/-小鼠软骨终板部位出现一定比例的软骨缺失，而缺失的部位又被病理性新骨所替代。软骨终板是椎间盘的组成结构之一，对维持椎间盘的正常生理功能具有重要作用[11]，其表面分布有细小孔隙，相邻椎体内血管的营养物质可以通过软骨终板孔隙弥散至髓核内层及纤维环，同时髓核及纤维环分泌的一些因子及代谢产物可经软骨终板通道运输出去，完成椎间盘的代谢[12]，软骨终板结构改变将影响椎间盘的营养供应，最终引起椎间盘退变。健腰密骨片组椎间盘软骨终板部位的骨化和缺损明显减少，说明健腰密骨片对维持OPG-/-小鼠椎间盘软骨终板的完整性具有一定的作用。

椎间盘软骨细胞分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖(Aggrecan)，Ⅱ型胶原呈丝状的胶原蛋白纤维可与Aggrecan相互交织成网状纤维结构，维持椎间盘的弹性及力学性能[13]，当软骨细胞外基质Ⅱ型胶原及Aggrecan过度丢失，胶原纤维网破坏，胶原蛋白的组成将由Ⅱ型胶原转变为Ⅰ型胶原[14]。研究发现椎间盘退变过程中，软骨细胞内Ⅱ型胶原表达下降及Ⅰ型胶原合成的增加将打破椎间盘内胶原组成的比例平衡，导致椎间盘原有的生理功能下降[15]。Ⅹ型胶原是肥大软骨细胞(终末端软骨细胞)的标志性分子，免疫组化结果发现健腰密骨片能够促进OPG-/-小鼠椎间盘软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的表达，下调Ⅹ、Ⅰ型胶原蛋白表达。另一方面，健腰密骨片促进OPG-/-小鼠椎间盘组织Aggrecan mRNA的表达，抑制Col10α1 mRNA表达，说明健腰密骨片具有促进软骨细胞基质分泌、抑制软骨细胞肥大、改善软骨细胞代谢的作用。

以上研究提示健腰密骨片可能通过干预软骨细胞的基质代谢延缓OPG-/-小鼠出现的椎间盘退变，但是具体通过何种途径代偿OPG并不清楚，后续将进一步深入研究。以上结果提示健腰密骨片不仅可以治疗骨质疏松症，还可以延缓椎间盘退变，为临床应用该方治疗椎间盘退变性疾病提供实验数据，还提示补肾法是治疗骨代谢与脊柱退行性疾病的重要方法。