基于网络药理学分析右归丸治疗糖尿病性勃起功能障碍的作用机制

翟新宇 谈鸣岳 葛旻垚 万 众 徐东亮

上海中医药大学附属曙光医院泌尿中心（上海 201203）

糖尿病性勃起功能障碍（diabetic erectile dysfunction,DED）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）常见的慢性并发症之一，主要表现为阴茎不能达到或维持足够的勃起以完成满意的性生活，病程在3个月以上。中国是DM第一大国，70%的DM男性患者都会引发不同程度的勃起功能障碍（erectile dysfunction,ED）[1]。正常人群的ED发病率仅为18%，而DM人群的ED发病率是正常人群的4倍，发病时间较正常人群要早10年，并随着年龄的增长和DM病程的延长发病率呈逐渐上升趋势[2-3]。DED的发生严重影响患者的生活质量、心理健康及夫妻感情，甚至影响社会的和谐稳定。因此，积极治疗DED具有重要的临床意义。

几千年来，中医药一直被用来治疗一系列疾病。由于中医药疗效显著，副作用小，已被世界各地越来越多的人所认可[4]。右归丸是由明代著名医学家、温补学派创始者张仲景所创，由附子、肉桂、鹿角胶、熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、当归、杜仲、菟丝子10种中草药组成。该方剂具有“滋阴补肾、填精止遗”的功效，先前的临床研究证实，右归丸具有良好的改善糖尿病性勃起功能障碍的作用[5]。然而，对于右归丸治疗糖尿病性勃起功能障碍的作用机制尚不清楚，其主要成分和关键靶点的药效学性质尚待确定。

网络药理学可以通过不同层次的网络构建系统地揭示药物作用靶点与疾病靶点之间的关系，从微观层面观察复杂药物对多靶点疾病的干预和影响[6]。网络药理学研究策略的整体性、系统性与中医的整体理念和辨证论治理论不谋而合，为中医药的现代医学解读提供了一条新颖的路径[7]。鉴于临床获得右归丸治疗DED患者海绵体样本的伦理局限性，我们采用网络药理学的方法筛选右归丸中各单味药的活性成分及作用靶点，检索已知的DED相关靶点，对右归丸干预DED的潜在关键作用靶点的生物功能进行预测，并分析其作用通路，为揭示右归丸的科学内涵和进一步挖掘右归丸其他临床应用奠定基础。

材料与方法

一、右归丸活性成分筛选及潜在作用靶点预测

本研究利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID数据库(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)收集右归丸中各味中药相关的活性成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug-likeness,DL)≥0.18为筛选标准[7]，得到符合条件的活性成分靶点信息。

二、疾病靶点的预测

登录GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数 据 库（https://omim.org/），以“糖 尿 病性勃起功能障碍”为关键词，检索筛选出疾病相关基因，通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）进行确认并转换后，剔除重复靶标，整理成DED疾病靶点数据库。

三、中药活性成分-靶点网络构建

将中药活性成分相关靶点与疾病相关靶点取交集，通过韦恩图将其可视化，并利用Cytoscape3.7.2软件构建中药-活性成分-靶点网络图。

四、PPI网络的构建和核心靶点的筛选

将得到交集基因的信息导入在线数据库STRING（http://string-db.org/），筛选最小相关分数大于0.4的节点，去除无关联的单个节点，获得的剩余节点及关系导入Cytoscape3.7.2软件绘制PPI网络，并通过计算每个节点的degree值筛选出核心靶点。

五、靶点基因生物信息富集分析

将右归丸作用靶点导入DAVID数据库（https://DAVID.ncifcrf.gov），限定物种为人，进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，筛选P<0.05的生物过程及信号通路，取排名前20条信号通路用R包（ggplot2）绘图将其可视化。

六、基因-通路网络构建

为进一步筛选出明显富集在通路中的核心作用靶基因，利用Cytoscape3.7.2构建基因-通路网络图。

图1 右归丸治疗DED的网络药理学分析流程图

结 果

一、右归丸活性成分及作用靶点信息收集

通过TCMSP、TCMID平台检索符合标准的右归丸活性成分，剔除重复值后共86个。其中附子有效成分6个，作用靶点20个，当归有效成分2个，作用靶点53个，杜仲有效成分23个，作用靶点216个，枸杞子有效成分35个，作用靶点208个，鹿茸胶有效成分1个，作用靶点4个，肉桂有效成分1个，作用靶点19个，山药有效成分12个，作用靶点80个，山茱萸有效成分14个，作用靶点70个，熟地黄有效成分2个，作用靶点31个，菟丝子有效成分10个，作用靶点222个，将所获得的活性成分预测靶点导入Uniprot数据库进行基因标准化，去除重复值，共得到作用靶点基因227个。

二、糖尿病性勃起功能障碍靶点的收集

使用GenCards数据库获得相关靶点784个，OMIM数据库获得295个，删除重复值，合并后共收集到DED潜在靶基因1061个。

三、中药-疾病交集基因韦恩图

计算得到右归丸与DED交集靶点78个，说明右归丸可能通过以上78个靶点作用于DED，并用R包绘图将其可视化，见图2。

图2 药物-疾病交集基因韦恩图

四、中药-活性成分-靶基因网络分析

将78个作用靶点所对应的中药活性成分，运用Cytoscape3.7.2软件构建中药-活性成分-靶基因网络（见图3），网络中共有152个节点和365条边，包含74种活性成分，78个作用靶点，每条边表示化合物和靶点之间的相互作用关系。经过和核心靶基因对比筛选，获得degree值排名前五的核心中药活性成分信息及对应靶点数目，见表1。

图3 中药-活性成分-靶点网络

表1 核心中药活性成分信息及对应靶点数目

五、PPI网络分析

将得到交集基因的信息导入在线数据库STRING，筛选minimum required interaction score大于0.4的节点，去除无关联的单个节点，获得的剩余节点及关系导入Cytoscape3.7.2软件绘制PPI网络。得到的网络图由77个节点和737条边组成；进一步按degree值进行筛选，根据“右归丸-活性化合物-潜在作用靶点”网络与PPI网络中的关键作用靶点相互映射，推测右归丸的有效成分可能通过VEGFA（degree值51）、IL-6（degree值50）、CASP3（degree值44）、NOS3(degree值39)、IL-1β(degree值38)这5个核心靶点发挥改善糖尿病性勃起功能障碍的作用，见图4。

图4 右归丸核心蛋白网络互作图

六、GO功能富集与KEGG通路富集分析

将得到78个作用靶点通过DAVID数据库进行GO与KEGG富集分析，共有1509条生物功能显著富集（P＜0.05），见图5。1332个在生物过程（BP）中富集，75个在细胞成分（CC）中富集，100个在分子功能（MF）中富集。选择排名前20的GO中条目绘制柱状图，主要涉及抗菌反应、脂多糖反应、细菌分子反应、活性氧水平反应、第二信使介导信号转导、乙醇反应、G蛋白-偶联第二信使环核苷酸受体信号通路等生物过程。细胞成分（CC）主要有：膜筏、膜微域、膜区、神经元胞体等。分子功能（MF）为：G蛋白-偶联胺受体活性、细胞因子受体结合、肾上腺素能受体活性、儿茶酚胺结合、铵离子结合、核受体活性等。KEGG通路网络分析结果显示，富集靶基因数目较多，且具有较大意义的通路为：神经活性配体-受体相互作用信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化产物-受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化信号通路、钙信号通路等，见图6。

图5 GO分析得出的排名前二十条目的BP、CC、MF气泡图

图6 KEGG富集分析前二十条信号通路

七、基因-通路网络分析

将排名前20的KEGG通路信息和相应富集在这些信号通路上的基因导入Cytocape3.7.2软件构建基因-通路网络，见图7。网络包含70个节点，203条边，其中富集基因50个，信号通路20条。将这些节点进行分析，degree值越大，图形面积越大，代表目标基因或通路在网络中发挥的作用越大。

图7 富集基因-KEGG信号通路图

讨 论

糖尿病性勃起功能障碍是在糖尿病进展过程中出现的一种慢性并发症，并随着病程的延长，发病率呈上升趋势。DED的发病机制复杂，涉及多基因、多靶点的病理机制，目前主要学说涉及神经病变、血管内皮细胞病变、雄激素水平改变等[8]。一线治疗主要为口服西地那非，但有增加心脑血管意外的风险。近年来，中医药治疗DED的研究逐渐增多，因其安全性高、不良反应小、患者接受度好，在临床应用上逐渐被认可。

中医虽没有DED的病名，但糖尿病属中医“消渴病”范畴，勃起功能障碍属“阳痿”范畴，DED可认为是消渴所致阳痿。阳痿病机主要是肾阳亏虚，命门火衰，阴器冷缩，痿而不起。而肾阳不足是源于消渴日久，耗伤真阴，导致肾精亏损。由于阴阳互根互用，病程日久，必阴损及阳，导致肾阴阳两虚。消渴所致阳痿是以肾阳虚为主要矛盾的阴阳两虚之证，治疗当以温肾填精、壮阳起痿为主，同时兼顾补肾滋阴。右归丸是明代著名医学家、温补学派创始者张景岳所创制的阴中求阳代表方。方中用滋阴药“熟地黄、枸杞子、酒萸肉、山药、当归”补养精血以培其本，再配合补阳药“炮附子、肉桂、鹿角胶、菟丝子、盐杜仲”温肾壮阳，诸药阴阳双补，阴中求阳，使阳气得阴生化无穷，可以温肾填精、壮阳起痿，主治命门火衰之证。右归丸方证与消渴所致阳痿病机吻合，故中医用药常选用右归丸治疗DED，并佐以临证加减。

网络药理学从药物、疾病之间相互作用的整体性和系统性出发，采用复杂网络模型表达和分析研究对象的药理学性质，为中药多成分、多途径和多靶点的作用机制进行整合及阐明，为基础实验研究提供方向。

结果发现，槲皮素、Cinchonan-9-al,6'-methoxy-,(9R)-、(-)-Tabernemontanine（丹参碱）、山奈酚、β-谷甾醇可能是右归丸治疗的DED的主要活性成分。其中槲皮素与山奈酚均属黄酮类化合物，已有多项研究证实[9-10]，黄酮类物质具有抗氧化、抗炎、抗心脑血管疾病等药理活性，有效抑制炎症及纤维化的进展，在治疗糖尿病相关并发症中起到重要作用。其中，槲皮素可以有效降低醛糖还原酶的活性，降低AGE的生成，抑制AGERAGE信号通路引起的糖尿病组织（如糖尿病肾脏、糖尿病心脏）相应的氧化应激、细胞凋亡等病理过程[11]，同时能改善DM-ED模型大鼠的血管内皮功能，增加阴茎海绵体血管平滑肌窦压(ICP)，增强一氧化氮合酶的活性和亚型的表达[12]。山奈酚属于过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂，具有增强脂肪组织及骨骼肌葡萄糖储运的作用，能够提高胰岛素敏感性，被广泛地应用于糖尿病及相应并发症的治疗。山奈酚可通过调节血管活性相关因子的动态平衡，从而发挥对微血管病变的保护作用[13]。β-谷甾醇是动植物细胞膜重要的组成之一，具有抗氧化、抗炎、降血糖等药理活性。研究发现[14]，β-谷甾醇可以有效清除氧自由基，降低细胞内过氧化物酶的水平，发挥抗氧化作用；通过抑制巨噬细胞IL-6活性，减少IL-1、TNF等炎性因子的分泌，起到抗炎的作用。因此，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可能是右归丸改善DED的关键成分。

通过对活性成分-疾病靶点分析，根据度值的大小得出右归丸与DED相互作用的关键节点有VEGFA、IL6、CASP3、NOS3、IL1β。VEGF家族是一类多功能的细胞因子，在血管生成中具有重要的调控作用。在大鼠和人阴茎组织的内皮细胞和平滑肌细胞中都发现了VEGF信号传导途径[15-16]，在大鼠阴茎海绵体内注射VEGF，可以有效改善ED[17-18]。IL-6、IL-1β为两种炎症因子，随着糖尿病病程的延长，组织分泌大量的炎症介质及细胞因子，降低炎症介质及细胞因子对于糖尿病相关并发症的治疗至关重要。NOS3是内皮型一氧化氮合酶，NOS3催化左旋精氨酸产生NO是阴茎勃起的关键物质，糖尿病大鼠阴茎海绵体组织内的NOS活性显著降低且随糖尿病病程的延长而下降，引起阴茎海绵体局部NO水平降低，导致ED[19-20]。CASP3是细胞凋亡的标志性蛋白，随着糖尿病病程的进展，患者糖、脂代谢紊乱使全身大动脉发生粥样硬化，血管、微血管病变，导致海绵体缺血、缺氧，海绵体平滑肌数量减少，纤维化程度增加及海绵体细胞凋亡增加，同时发生阴茎海绵体白膜纤维减少，最终促使DED发生，众多研究均已证实细胞凋亡在DED的发生、发展过程中扮演一定角色[21-22]。右归丸中筛选出的核心成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇均对炎症因子有不同程度的控制。本研究筛选出来的关键活性成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可以有效控制氧化应激反应、减轻糖尿病的炎症反应、降低血管内皮细胞凋亡蛋白表达、保护血管内皮等功能[23-25]，临床上可能通过调控这些关键靶点从而发挥改善DED的作用。

从GO分析可知，右归丸可通过对多种生物学过程和和分子功能的调控来改善DED的发生发展，核心靶点主要富集在生物过程（BP）环节，其关联的生物过程主要有调节参与抗菌反应、脂多糖反应、细菌分子反应、活性氧水平反应等。糖尿病是一种慢性炎症反应，可以启动多条信号通路，导致机体氧化应激反应从而引起全身血管炎症因子释放增加，进而引起血管平滑肌增生、血管粥样硬化，血管内NO释放降低，促发DED的发生[26-27]。根据KEGG的富集结果可知，右归丸作用于DED的核心靶点主要富集在神经活性配体-受体相互作用信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路。糖尿病引起的神经病变是发生ED的重要原因[28]。自主神经病变可以引起阴茎静脉漏的形成,而周围神经病变可引起神经反射传导障碍,支配阴茎的舒血管肠肽能、胆碱能肾上腺素能神经损坏,导致与阴茎勃起有关的神经递质浓度改变,最终导致ED。AGE-RAGE信号通路激活可直接灭活NO或间接减少NO生成，增加缩血管因子水平，同时还能引起海绵体组织内氧化应激反应，导致血管炎症因子产生增多、血管内皮细胞凋亡，从而引发ED，抑制该信号通路可有效改善DED[29]。PI3K-AKT信号通路为细胞内重要信号转导通路之一，是细胞功能的关键调节因子。该信号通路激活，可有效增加阴茎海绵体平滑肌细胞内NO含量，进而改善DED[30-31]。

综上所述，本研究基于网络药理学明确了右归丸主要通过VEGFA、IL-6、CASP3、NOS3、IL-1β等靶点调节神经活性配体-受体相互作用信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路进而改善DED，但本研究结果有待于后期进一步实验验证。