PCR荧光探针法、乳胶法及培养法检测生殖道分泌物中沙眼衣原体、淋球菌和解脲支原体的优劣分析

廖春洁 叶美萍 顾 昕 石 梅 周平玉,*

1.安徽医科大学上海皮肤病临床学院（上海 200050）；2.上海市皮肤病医院（上海 200050）

淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）和解脲支原体（Ureaplasma urelyticum，UU）是世界范围内引起性传播感染的常见病原体[1-2]。沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌感染泌尿生殖系统时会导致多种症状，男性患者出现尿道炎、附睾炎、前列腺炎、不孕症，女性患者表现为阴道炎、宫颈炎、输卵管炎、子宫内膜炎、异位妊娠、不孕等，而且女性患者症状常隐匿，若不治疗或治疗不当可通过垂直传播导致胎儿流产、早产、新生儿结膜炎、新生儿肺炎等后果，严重危害孕产妇及新生儿的健康[3-5]。临床上能够采用快速、敏感、特异性高的检测技术对沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌感染进行诊断十分重要。

性病病原体常见的检测方法有病原体培养、特异性抗原抗体检测、涂片镜检、血清学试验及分子检测等，各种方法各有其利弊，某些检测方法存在结果判读主观性强（解脲支原体培养），灵敏度低（乳胶法检测沙眼衣原体），一些病原体（如沙眼衣原体）存在培养困难、培养操作复杂、临床不易实现等问题[6]，影响临床的及时诊断和治疗。荧光定量PCR技术是近30年来具有革命性的检测技术，有研究显示该方法对生殖道分泌物样本检测具有高灵敏度，并且检测周期短、特异性强、可以进行定量分析，但无法判断病原菌的耐药是其缺陷[7-8]。为了探究不同检测方法对沙眼衣原体、淋球菌和解脲支原体检测的优劣性，本研究采用PCR荧光探针法对本院2018年8月-2020年8月性病门诊采集的生殖道分泌物中的沙眼衣原体、淋球菌和解脲支原体进行检测，并与相应的乳胶法及培养法的结果进行比较，探究不同检测方法对分泌物中沙眼衣原体、淋球菌及解脲支原体的检出率差异，并分析其对于临床的意义。

材料和方法

一、研究对象

选取2018年8月到2020年8月就诊于上海市皮肤病医院性病科门诊疑似泌尿生殖道感染的患者。

二、泌尿生殖道分泌物样本采集

（一）男性样本采集：使用无菌拭子轻柔伸入尿道2~3 cm处轻轻转动拭子取出分泌物；（二）女性样本采集：使用无菌拭子插入宫颈口1~2 cm内旋转数次并停留数秒后取出。将取样后的拭子按检测要求浸入无菌生理盐水和置入培养基中保存。（所有患者均在抗生素治疗前进行采样）

三、主要试剂及仪器

沙眼衣原体、淋球菌和解脲支原体的PCR荧光探针试剂盒购自上海科华生物工程有限公司；解脲支原体检测（培养法）试剂盒购自珠海迪尔生物工程有限公司；衣原体抗原检测（乳胶法）试剂盒购自杭州艾博生物医药有限公司；Thayer-Martin选择性琼脂基础（MTM琼脂基础）培养基购自上海伊华医学科技有限公司。PCR仪器：ABI7500实时荧光PCR仪器。

四、样本的检测

（一）PCR荧光探针法

严格按照PCR荧光探针试剂盒说明书进行操作，先通过热裂解法提取分泌物样本中病原微生物的DNA，以其作为模板，进行产物扩增。PCR反应条件为：50℃UNG酶处理2 min，93℃预变性2 min；93℃变性10 s，60℃退火、延伸及检测荧光30 s，共40个循环。反应完成后，读取实验结果，阳性结果为样本循环域值(cycle threshold，Ct)≤37，而Ct无数值或>40为阴性结果，若样本阈值37

（二）沙眼衣原体抗原检测法（乳胶法）

沙眼衣原体采用抗原检测法（乳胶法）试剂盒进行检测。按照说明书进行操作，在分泌物样本中加入标本处理液A 8滴，混匀后再滴加标本处理液B 8滴，待混匀样本充分裂解后滴入反应板加样孔内，10~20min后观察结果。阳性结果为质控区和反应区均出现红色条带；仅在质控区出现红色条带则为阴性结果。

（三）淋球菌检测（培养法）

将采集的分泌物标本立即分区接种至MTM琼脂基础培养基中，将平皿置于35℃，5%CO2的培养箱中培养48~72小时，观察细菌的生长。挑取圆形、稍凸、湿润光滑、直径为0.5~1mm、半透明或灰白色菌落，分别进行涂片革兰氏染色和氧化酶试验。阳性结果为：革兰氏染色后镜下可见革兰氏染色阴性肾形双球菌以及氧化酶试验为阳性。

（四）解脲支原体检测（培养法）

解脲支原体检测（培养法）试剂盒进行检测。试剂盒使用液体培养基培养法，接种生殖器分泌物样本后，置37℃培养24~48 h。当酚红指示剂由黄转红，表示有解脲支原体生长，判为阳性；若指示剂仍为黄色则判为阴性。

五、统计学分析

应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，每种病原菌不同检测方法检出率的比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、PCR荧光探针法与乳胶法检测生殖道分泌物中沙眼衣原体的结果比较

共采集587例患者的生殖道分泌物同时用于沙眼衣原体的PCR荧光探针法和乳胶法检测，其中男性289名，女性298名。患者平均年龄为36.4±10.7岁。PCR荧光探针法对沙眼衣原体的阳性检出率为11.9%（70/587），显著高于乳胶法2.9%(17/587)，差异具有统计学意义（P<0.001）。对性别和不同年龄组的检出结果进行分析，结果显示男性和女性中PCR荧光探针法对沙眼衣原体的阳性检出率均明显高于乳胶法，差异均有统计学意义（P<0.001）；各年龄组PCR荧光探针法的检出率也均高于乳胶法，除>40岁年龄组差异无统计学意义（P>0.05）外，其他年龄组差异均有统计学意义（P<0.001）。其中＜20岁组样本较少，因此未进行统计学分析。见表1。

表1 PCR荧光探针法与乳胶法检测沙眼衣原体结果的比较

二、PCR荧光探针法与培养法检测生殖道分泌物中淋球菌的结果比较

共采集609例患者的生殖道分泌物用于淋球菌的PCR荧光探针法和培养法检测，其中男性308名，女性301名。609例患者的平均年龄为36.4±10.8岁，范围16~74岁。PCR荧光探针法对淋球菌的阳性检出率9.0%(55/609)略高于培养法7.4%(45/609)，差异无统计学意义（P>0.05)。同时在性别及各年龄段分组中PCR荧光探针法的检出率都略高于培养法，差异并无统计学意义（P>0.05)。其中<20岁组样本较少，未进行统计学分析。见表2。

表2 PCR荧光探针法与培养法检测淋球菌结果的比较

三、PCR荧光探针法与培养法检测生殖道分泌物中解脲支原体的结果比较

共采集1022例患者的生殖道分泌物用于解脲支原体的PCR荧光探针法和培养法检测，其中男性503名，女性519名。1022例患者的平均年龄为36.4±10.8岁，范围14~75岁。PCR荧光探针法对解脲支原体的阳性检出率为44.9%（459/1022）高于培养法40.0%（409/1022）,差异具有统计学意义（P<0.05）。不同性别及各年龄段分组中PCR荧光探针法的检出率都略高于培养法，但差异只在男性组中具有统计学意义（P<0.05），在其他组中差异并无统计学意义（P>0.05）。其中＜20岁组样本较少，因此未进行统计学分析，见表3。

表3 PCR荧光探针法与培养法检测解脲支原体结果的比较

讨 论

淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体是引起泌尿生殖道感染的主要病原体，其感染生殖道后可引起多种生殖道症状，在男性患者中可引起尿道炎和附睾炎，女性患者可出现盆腔炎和宫颈炎等，但大部分女性患者感染后，其临床过程常隐匿、症状轻微，不易引起重视，耽误治疗，致使病情迁延，可能会发展为不孕症、异位妊娠和慢性盆腔疼痛等严重后果[9-11]。因此，临床上采用适合的检测方法对性病病原体进行准确诊断并指导临床合理用药，对阻止病情迁延十分重要。

临床上对于沙眼衣原体的检测主要包括乳胶法和PCR荧光探针法，乳胶法检测沙眼衣原体操作简单、快捷，但敏感性不足，实验室前期的研究结果显示PCR探针法对沙眼衣原体的阳性检出率明显高于乳胶法（9.95%vs4.21%）[12]，我们的研究结果也显示,PCR荧光探针法对于沙眼衣原体的检出率显著高于乳胶法（11.9%vs2,9%），PCR探针法可以很大程度上提高沙眼衣原体的阳性检出率，避免患者漏诊，所以在临床上建议采用PCR荧光探针法对沙眼衣原体进行检测；淋球菌和解脲支原体的检测主要采用培养法和PCR荧光探针法，培养法是病原体检测的“金标准”，培养法检测淋球菌及解脲支原体具有高度的特异性，同时可以进行病原菌耐药性分析，但培养法也存在培养时间长，培养结果受到标本采集、运送、保存等因素的影响，出现假阴性[13]，有研究显示PCR荧光探针法对淋球菌的阳性检出率高于培养法（6.64%vs4.16%），对解脲支原体的检出率与培养法相近(37.6%vs36.8%)[14]，本研究结果显示PCR荧光探针法对淋球菌的阳性检出率略高于培养法(9.0%vs7.4%)，差异并无统计学意义，但我们的结果出现10例PCR荧光探针法结果阳性而培养法阴性的病人，PCR探针法在检测隐匿感染和症状不明显的淋病患者时优于培养法[12]；PCR荧光探针法对解脲支原体的阳性检出率高于培养法（44.9%vs40.0%），有研究显示解脲支原体可以引起女性不孕[15],但也有研究显示解脲支原体可能是条件致病菌，因此尽管解脲支原体培养法有结果判读主观性强的缺点，但依据核酸阳性（PCR探针法检测）来治疗解脲支原体感染可能存在过度治疗和抗菌素滥用[16]。目前临床已经广泛应用PCR荧光探针法检测沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌，PCR荧光探针法检测病原体具有特异性高、敏感性强、检测周期短和污染概率小等优势[17-18]，但该方法无法对病原菌进行药物敏感性分析，不能指导临床合理用药，无法完全替代传统的培养法。随着抗生素的广泛应用，淋球菌对于抗菌药物的耐药现象越来越严重，多重耐药菌的出现已经引起公共卫生的重视[19]，解脲支原体耐药也同样受到临床关注[20],故采用能够进行耐药分析的培养法对淋球菌和解脲支原体进行检测对临床选择正确的治疗方法具有十分重要的意义。

值得注意的是，我们对不同年龄段性病病原体感染情况进行分析，不考虑性别因素，结果显示患者主要集中在20~40岁年龄段，该年龄层的人群正处于性活跃期，不及时治疗会增加性病传播的风险，同时该年龄的人群正处于生育阶段，沙眼衣原体、淋球菌和解脲支原体的感染都可能会导致患者不孕不育及增加不良妊娠的风险，所以能够早期准确诊断、及时有效治疗、避免并发症尤为重要。PCR探针法检测生殖道分泌物中的沙眼衣原体、淋球菌和解脲支原体时，不仅可以提高病原菌的阳性检出率，同时可以做到一支采样拭子同时检测多种病原体，减少了男性患者多次采样的痛苦,对隐匿感染的女性也具有重要的筛查意义，是一种值得推荐的性病病原体检测方法，对于考虑淋球菌或解脲支原体感染的患者时，需增加培养法同时检测，根据药敏实验结果，指导临床准确用药，提高治疗效果，避免不孕不育、不良妊娠等严重结局的发生。