紫苏褐斑病菌的分离鉴定及抑菌剂的室内毒力测定

赵刘赵，商志伟，杨小华，罗 充*

(1.贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550000；2.贵州省农业科学院 油菜研究所，贵州 贵阳 550006；3.贵州省铜仁市碧江区农业农村局，贵州 铜仁 554300)

【研究意义】褐斑病是造成作物大量减产的常见病害之一，其具有发病快，传染力强等特点。一旦有植株感染可快速传播，使大批植株感染，导致叶片枯死、脱落，严重减产。【前人研究进展】植物的褐斑病多由链格孢属真菌(AlternariaNees)引起[1-5]，且往往使受感染的植物产生相应症状。猕猴桃褐斑病的典型症状为叶片上具有明显轮纹的褐色坏死斑，病斑直径为1～2.5 cm[6]；柑橘感染褐斑病后出现茎干底部腐烂、幼苗死亡、流胶等症状[1]。链格孢属真菌的分生孢子营腐生或寄生，其代谢产物含毒素，可使农作物产生黑斑病或褐斑病等病症，进而产生叶斑和组织腐烂等[6]。链格孢属真菌不仅对植物产生危害，其还能产生70多种有毒代谢物，摄入被链格孢毒素感染的食品可使人、畜产生中毒现象，严重时还可能致畸和致癌等[7]。甲霜锰锌、烯酰锰锌和代森锰锌对防治植物真菌有明显效果，其中，代森锰锌常被用于防治植物的褐斑病[6，8-9]。【本研究切入点】目前关于紫苏的研究多集中在紫苏成分的分离纯化或基因层面[10-15]，鲜见关于紫苏褐斑病的研究。【拟解决的关键问题】鉴于此，采用形态学与分子生物学相结合对从紫苏褐斑病病叶分离到的菌株进行鉴定，在此基础上采用抑菌圈法室内测定3种常见抑菌剂对紫苏褐斑病的防治效果，以期为规模化生产紫苏褐斑病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 病原 感染紫苏(PerillafrutescensL.Britt.)叶片，采自贵州师范大学生命科学院实验基地，叶片即采即用。

1.1.2 试剂 DP336试剂盒，成都擎科梓熙生物技术有限公司。

1.1.3 药剂 72 %甲霜锰锌(主要成分为8 %甲霜灵、64 %代森锰锌)，允发化工(上海)有限公司；69 %烯酰锰锌(主要成分为9 %烯酰吗啉、60 %代森锰锌)，江苏辉丰农化股份有限公司；70 %代森锰锌可湿性粉剂，陕西道森农业生态科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌株的分离纯化与鉴定 ①材料预处理。选取新鲜染病的紫苏叶片，将其置于流动自来水下冲洗30 min，然后浸泡于75 %酒精中在超净工作台上消毒6 s左右，取出用无菌水将其表面多余的酒精冲洗干净后，使用2 %升汞溶液消毒2 min，再用无菌水冲洗叶片表面残余药品溶液，之后使用高压灭菌处理的干燥滤纸擦干叶片备用。②分离纯化。用消毒的解剖针在叶片有斑块的地方轻刮几下，将刮下的病菌孢子用划线法接种至PDA培养基上，然后置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养2～3 d。挑选分离培养基中数量和面积均占主导地位的菌落，用消毒解剖针刮下其孢子，在PDA培养基上进行接种。将接种的培养基置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养2～3 d；反复接种培养直至培养基上只有单一菌落即完成纯化工作。③鉴定。以纯化的培养基制备孢子悬浮液，用DP336试剂盒提取菌种DNA，并以此DNA为模板，以通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增。PCR检测病原菌株反应条件：94 ℃预变性5 min，30个循环(98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s)，72 ℃终延伸，保存于4 ℃。扩增后的片段溶于无菌去离子水中，置于-20 ℃保存备用。用1 % Tsingke高纯度低电渗琼脂糖电泳，在150 V、100 mA的环境下电泳20 min；然后用DNA凝胶回收试剂盒对所需DNA目的条带进行切割，直接对纯化后的PCR产物进行引物测序。

1.2.2 抑菌剂的筛选 将70 %代森锰锌、72 %甲霜锰锌和69 %烯酰锰锌按照使用说明稀释成500、600、700和800倍液。将事先纯化好的培养基中的真菌孢子制备成1×106个/mL孢子悬浮液，在PDA平板培养基上接种0.1 mL的孢子悬浮液，于25 ℃黑暗恒温培养24 h。将直径6 mm的无菌滤纸片在药品稀释液中浸没10 min，取出放在均匀涂抹菌液且已培养24 h的培养基中，每个培养基中均匀放置4片滤纸(分别经同一药品不同浓度的药液浸泡)，对照组放置浸泡清水的滤纸片。共计13个处理，3次重复。于25 ℃黑暗恒温培养5 d后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径并记录，计算抑菌率。根据浓度(x)和抑菌率(y)拟合3种药剂的毒力回归方程，并计算EC50。

抑菌率=(处理直径-对照直径)/处理直径×100 %

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010和Spss 25对数据进行统计与处理。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

2.1.1 形态学 从图1可见，病原菌菌落为圆形或近圆形，中间为深褐色，边缘为灰白色，随着菌落的扩大，褐色面积逐渐增大，最终变为黑色，有丰富气生菌丝，表面为绒毛状；分生孢子梗多为单生或簇生，形状多为长卵圆形、棒形或梨形，有多个横隔膜，分隔处有缢缩。结合菌落形态、分生孢子类型等参照《中国真菌志》[16]，初步判断该菌株为链格孢属真菌(Alternariasp.)。

2.1.2 分子生物学 从图2～3看出，利用ITS4/ITS4真菌通用引物对试剂盒提取到的病原菌DNA进行PCR扩增，获得扩增片段大小为700 bp左右。将样本ITS测序结果在NCBI库中与登记的物种进行同源性检索比对发现，其与Altemariaaltemata(序列号MG755752.1)的同源率达100 %，再结合形态学鉴定结果，确定该菌株为链格孢属真菌(Alternariaalternata)。

2.2 不同药剂的抑菌效果

从图4和表1看出，PDA培养基上纸片周围出现明显的抑菌圈，不同药品及其不同浓度所产生的抑菌圈大小不同。

2.2.1 抑菌率 不同药剂的抑菌率均与稀释倍数成反比，即随着稀释倍数增加，各药剂抑菌率呈下降趋势。500～800倍，72 %甲霜锰锌、69 %烯酰锰锌和70 %代森锰锌的抑菌率分别为61.9 %～73.4 %、66.3 %～69.7 %和64.3 %～67.7 %，以稀释500倍时3种药剂的抑菌率均最大。72 %甲霜锰锌的抑菌率波动较大，最大值与最小值相差11.5 %，二者存在显著差异；其次是69 %烯酰锰锌，相差4.8 %；70 %代森锰锌相差最小，相差3.4 %。在最大稀释倍数(800倍)时，70 %代森锰锌的抑菌效果最佳，为66.3 %；72 %甲霜锰锌的抑菌效果相对较差，为61.9 %。70 %代森锰锌和69 %烯酰锰锌各浓度的抑菌率无显著差异，72 %甲霜锰锌800倍液的抑菌率与该药剂其余浓度间差异显著。经拟合浓度(x)与抑制率(y)得到3种药剂的毒力回归方程：y代森锰锌=6.92+0.52x(R=0.952*)，y甲霜锰锌=9.78+1.52x(R=0.970*)和y烯酰锰锌=6.61+0.43x(R=0.956*)，其相关系数均接近1，说明，据此得出的EC50可信度较高。其中，69 %烯酰锰锌EC50为0.16 μg/mL，菌丝整体抑制效果最好；70 %代森锰锌的抑制效果其次，其EC50为0.19 μg/mL；72 %的甲霜锰锌EC50为0.76 μg/mL，对菌丝的抑制未产生明显效果。

2.2.2 抑菌圈直径 不同药剂随着药品稀释倍数增加其平均抑菌圈直径均逐渐减小。500～800倍，72 %甲霜锰锌、69 %烯酰锰锌和70 %代森锰锌的抑菌圈直径分别为15.76～22.53、16.81～18.56和17.79～19.79 mm，3种药剂的抑菌圈直径均在最低稀释倍液(500倍)时达最大。70 %代森锰锌和69 %烯酰锰锌各浓度间抑菌圈直径无显著差异，72 %甲霜锰锌800倍液的抑菌圈直径与该药剂其余浓度间差异显著(图4，表1)。

表1 不同药剂各浓度处理病原菌的抑菌率与抑菌圈直径

3 讨 论

链格孢属真菌是世界上分布最广的真菌之一，可侵害多种植物，在作物间极易传播，造成不同作物相互感染，致使作物大量减产。因此，挑选容易购买，经济有效的抑菌剂十分重要。72 %甲霜锰锌、70 %代森锰锌和69 %烯酰锰锌均属于低毒高效的广谱性抑菌剂。研究结果表明，除在最高和最低浓度时药品抑菌率差异性显著外，3种药剂中间浓度的抑菌率差异不显著，可能因3种药品的有效成分均含有代森锰锌所致。3种药剂在高浓度时对链格孢属真菌有较好的抑制效果，与冯连荣等[9]的结果一致，但考虑到对植株本身的伤害和污染问题，选用较低浓度即有明显效果的抑菌剂最好。69 %烯酰锰锌EC50最低，为0.16μg/mL，对菌丝生长的整体抑制效果最好，可作为紫苏褐斑病防治的首选药物之一。同时，72 %甲霜锰锌的抑菌率大小差值较大，说明随着浓度减小，其抑菌效果将大幅下降，因此使用时应选择适宜存浓度。70 %代森锰锌也具有较好的抑制效果，500倍稀释液的抑菌率将近70 %，与刘娟等[1，9]的结果相似。

紫苏整个生长期均有可能感染褐斑病，灾害严重时可造成植株大片死亡，最终导致严重减产。除在紫苏感染时使用抑菌剂进行补救外，提高田间管理质量也十分重要。当植株开始出现枯斑时，应在早晨去掉叶面的水；当周围其他植物出现褐斑病病害时，应及时隔离或喷洒农药，防止大规模传染。

该研究对紫苏褐斑病的病原菌只鉴定到属，药剂筛选只能反映出3种药剂的室内效果。田间的实际施用效果及药剂交替喷施效果等问题还有待更深入的研究。同时，有研究表明[17]，在其他真菌病害的防治方面，植物提取液也有一定效果。因此，研究植物提取液对紫苏褐斑病的防治效果同样具有重要意义。

4 结 论

该研究确定紫苏褐斑病的病原菌株为链格孢属真菌(AlternariaNees)；3种常规广谱抑菌剂72 %甲霜锰锌、70 %代森锰锌和69 %烯酰锰锌的500～800倍液均对紫苏褐斑病有一定的防治效果，其中，69 %烯酰锰锌对菌丝生长的整体抑制效果最好，其EC50为0.16 μg/mL。