不同VIGS体系在棉花中沉默效率的研究

吴 洁，刘 帅，马晶晶，杨兆光，乔艳艳，赵 沛，吴珍平，操宇琳，张朝军

(1.江西省棉花研究所/国家棉花产业技术体系鄱阳湖综合试验站，江西 九江 332105;2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000;3.塔里木大学，新疆 阿拉尔 843300)

【研究意义】病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技术是20世纪90年代兴起的一种高通量、高效、快速的反向遗传学技术。其原理是目标基因接入病毒载体，形成重组病毒后侵染植株，目标基因片段转录成dsRNA，随后dsRNA被内切酶Dicer类似物切割成21～24 nt的siRNA，siRNA在植株中与一些特定的蛋白质相结合形成RNA 诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC与同源RNA互作，目标基因mRNA降解[1-3]。本文选用的2个VIGS体系棉花叶皱缩病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV)载体和烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)载体是棉花中常用的2种VIGS体系。通常2种载体都可以通过沉默叶绿素合成基因，从而得到植株的白化表型[4-5]。【前人研究进展】TRV载体是自2001年以来运用最广泛的VIGS载体，Gao等[6]在2011年将RNA病毒TRV介导的VIGS体系运用于研究棉花的基因功能。Tuttle等[5]在2008年通过用粒子轰击和农杆菌介导的方法建立了棉花中的DNA病毒CLCrV介导的VIGS体系。TRV体系在植株中的沉默持续时间短，而CLCrV体系表型可维持在棉花的整个生育期中[7-8],但对2个VIGS体系在棉花不同发育时期和不同部位沉默效率的研究较少。新霉素磷酸转移酶基因(neomycinphosphotransferaseⅡ,nptⅡ)是转基因植物中常用的选择性标记基因，它通过合成新霉素磷酸转移酶对卡那霉素(Kan)产生抗性。利用VIGS技术沉默转基因植株中的nptII基因会使得转基因植株丧失Kan抗性[9]。【本研究切入点】本研究以35S启动子驱动的抗Kan的nptII基因为目标基因，构建2种VIGS体系介导的基因表达沉默载体，通过农杆菌注射法侵染棉花子叶，对2个VIGS体系侵染的棉花植株不同时期及不同部位进行qRT-PCR检测。【拟解决的关键问题】比较2套VIGS体系在棉花中的基因沉默效率和沉默时间的差异，为验证棉花基因功能选取合适的VIGS体系提供参考，对棉花基因功能的研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究使用的棉花材料为含有抗KannptⅡ基因的常规陆地棉(GossypiumhirsutumL.)品种中棉所41(CCRI 41)，由中国农业科学院棉花研究所转基因课题提供。

TRV空载体大肠杆菌pYL-156，TRV阳性对照农杆菌，TRV辅助农杆菌pYL-192，CLCrV阳性对照农杆菌，CLCrV空载体大肠杆菌pCLCrVA，CLCrV辅助农杆菌pCLCrVB等皆由转基因实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞，农杆菌GV3101感受态细胞购自日本宝日医生物技术有限公司。

多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒(RNAprep Pure Plant kit)和质粒小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒、限制性内切酶、Taq酶及荧光定量试剂盒(SYBR®Premix ExTaq)购自日本宝日医生物技术有限公司，无缝克隆酶(ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit)购自南京诺维赞生物科技有限公司，凝胶回收试剂盒购自北京普洛麦格生物技术有限公司，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(AS)、2% -巯基乙醇、卡那霉素、利福平等其他生化试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1nptII基因的检测 取播种1周后的CCRI 41棉花整株，CTAB法[10]提取基因组DNA作为模板，根据NCBI中公布的nptⅡ基因序列(GenBank: AUA17992.1)，使用Primer Premier 5软件设计引物：nptII-F:CTATGACTGGGCACAACAGACAAT，nptII-R:TCGTCAAGAAGGCGATAGAAGG，扩增出的片段大小为 720 bp。

1.2.2 VIGS载体的构建 以CCRI 41基因组DNA为模板，使用Primer Premier 5软件设计构建2个VIGS体系所需引物：TRV-F-XbaI:AAGGTTACCGAATTCTCTAGACCGGATCAAGCGTATGCAG，TRV-R-BamH I: CGTGAGCTCGGTACCGGATCCAAG ATGG ATTGCACGCAGG，扩增片段大小为 350 bp左右；CLCRV-F-SpeI:CAAAATGGCATGCCTGCAGACTAGTCCGGATCAAGCGTATGCAG，CLCRV-R-AscI:AGACCCCGTTATTGTTACCGGGCGCGCCAA GATGGATTGCACGCAGG，扩增片段大小为 350 bp左右。使用南京诺维赞生物科技有限公司的无缝克隆酶将扩增到的目的片段与其相应的VIGS载体连接，经测序验证获得病毒重组干涉载体pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ。

1.2.3 农杆菌的制备和侵染 将得到的重组质粒pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞中(具体步骤参照说明书)。挑取阳性克隆菌落PCR检测正确后，将TRV体系中的阳性克隆菌落pYL-156-nptⅡ与pYL-156空载体农杆菌，pYL-192辅助载体农杆菌，TRV阳性对照农杆菌菌液和CLCrV体系中的pCLCrVA-nptⅡ阳性克隆菌落，CLCrV空载体pCLCrVA农杆菌，CLCrV辅助pCLCrVB农杆菌，CLCrV阳性对照农杆菌菌液，分别加入到含Kan、利福平(Rif)和硫酸庆大霉素(Gen)的LB液体培养基中，28 ℃，200 r/min，摇菌8～10 h。吸取 500 μl上述摇好的各菌液加入到Kan、Rif、Gen的LB三抗液体培养基中，并同时加入终浓度为10 mmol/L的MES和终浓度为20 μmol/L的AS，28 ℃，200 r/min摇菌过夜。取培养好的菌液于50 mL离心管中4000 r/min，4 ℃离心10 min收集菌体，加入适量重悬液(无菌蒸馏水中MES 10 mmol/L，AS 200 mmol/L，MgCl210 mmol/L)充分悬浮菌体，使用 Nanodrop2000C在 600 nm 波长下调整各菌液OD600=1.5左右。分别将已悬好的pYL-192辅助载体农杆菌和CLCrV辅助pCLCrVB农杆菌悬液与其相应VIGS体系目的基因、空载体、阳性对照农杆菌悬液分别按照体积1∶1混匀，25 ℃静置 3～6 h备用。

播种陆地棉CCRI 41种子，28 ℃，光照/黑暗=14/10h条件下培养 7 d后，取子叶平展、真叶还未冒出或刚冒出时的棉花幼苗，用注射器针头轻划一下子叶背面，用去掉针头的1 mL注射器将菌液从背面注入棉花子叶，使菌液侵染整个子叶，注射面积达到98 %以上。注射后的棉花植株避光处理12 h，再次置于正常光照(28 ℃，光照/黑暗=14/10 h)下继续培养[9]。

1.2.4 表型分析与PCR检测 观察2种体系TRV和CLCrV阳性对照棉花植株叶片白化时间和表型。当阳性对照叶片出现白化表型，取空白对照和nptⅡ沉默植株的叶片，用CTAB法提取DNA。设计TRV载体检测引物TRV-A-F1：GTGGACTTAGATTCTGTGAGTAAGG；TRV-A-R1：ACGGATCTACTTAAAGAA CCGTAGT，PCR扩增片段大小为 256 bp。设计CLCrV载体检测引物CLCrV-A-F1：GGGAGCTCCACTTGGGATAGGTTAAGAA；CLCrV-A-R1：CCATCGATGTCCCTTATTAACTTTAGGGC，PCR扩增片段大小为275 bp。检测2种病毒载体是否成功侵染棉花植株。

1.2.5 qRT-PCR分析 取注射过nptII基因和空载体15、30、45、60、75、90 d的棉花叶片，以及75和95 d的蕾、花、花药组织部位提取RNA。所用试剂盒为多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，具体方法参照说明)。将提取出的RNA用荧光定量反转录试剂盒(日本宝日医生物技术有限公司)进行反转录(具体方法参照说明)，获得2种体系的反转录产物cDNA。以棉花中的actin基因为内参基因，内参引物AF：5'-TTTGGCATCATACCTTT-3'，AR：5'-CACTGGCATATAGGGA-3'。设计检测nptⅡ基因表达的特异引物nptⅡ-Q-F: 5'-CACGAGGAAGCGGTCA-3' 和nptⅡ-Q-R：5'-CCTGCTTGCCGAATATC-3'，对不同组织样品中nptⅡ基因表达量进行qRT-PCR检测，所用试剂为TaKaRa SYBR®Premix ExTaq(日本宝日医生物技术有限公司，具体步骤参照说明)，所用仪器为Applied Biosystems 7500(Applied Biosystems，美国)。试验设置3个生物学重复和3个技术性重复，获得数据采用2-△△ct法计算相对表达量，使用EXCEL软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 中棉所41中nptⅡ基因的检测

对陆地棉CCRI 41棉花植株进行PCR检测，检测其基因组中是否含有nptⅡ基因，结果显示该品种植株能够扩增出nptⅡ基因片段(图1)，扩增片段大小为720 bp左右，与预期片段大小一致，扩增条带单一，无非特异条带，说明所选CCRI 41棉花植株基因组中含有nptⅡ基因片段。

2.2 2种病毒载体的构建

pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ 2个载体分别进行双酶切验证后，对构建好的TRV和CLCrV病毒沉默载体农杆菌进行PCR扩增，分别得到350 bp左右的片段(图2)，与预期片段大小一致，扩增条带单一，无非特异条带，表明目的载体pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ构建成功。

2.3 农杆菌侵染后棉花叶片表型及PCR检测

农杆菌侵染12 d后，接种TRV阳性对照的植株叶片从顶端开始出现白化表型，空白对照植株顶端叶片颜色正常为嫩绿色(图3-A)。侵染23 d后，接种CLCrV阳性对照的植株出现表型变化，顶端分生组织附近的幼嫩叶片开始出现白化表型，而空白对照叶片颜色正常未出现白化表型(图3-B)。取2个体系沉默nptⅡ基因和空白对照棉花植株叶片，提取DNA，PCR扩增检测TRV病毒载体和CLCrV病毒载体是否进入植株并起作用，扩增分别得到256和275 bp大小的片段(图4)，与预期片段一致，表明2个病毒载体已作用于棉花植株中。

2.4 2个病毒体系叶片中nptⅡ基因沉默效率比较

检测TRV体系和CLCrV体系15、30、45、60、75、90 d棉花叶片中nptⅡ基因的沉默效率，比较2个体系在棉花不同发育时期对目的基因沉默效率的持续性差异。与空载体对照相比，农杆菌接种15 d，TRV体系植株叶片表达量被高度抑制(图5)，沉默效率达到 99.6 %，而CLCrV体系在农杆菌接种后30 d，目的基因抑制效果达到最强，沉默效率达到 85 %，说明TRV体系比CLCrV体系对目的基因的沉默效率高且TRV体系的沉默效果更快。后期TRV体系对目的基因的沉默效率逐渐减弱，在注射农杆菌后75及90 d，沉默效率分别46 %和22 %，说明TRV体系对目的基因的沉默效率会随着棉花植株的生长逐渐减弱。CLCrV体系在60、75、90 d的沉默效率分别为84 %、82 %、77 %，说明CLCrV载体能够在棉花中持久、高效的诱导内源基因的沉默。

2.5 2个病毒体系棉花生殖器官中nptⅡ基因沉默效率比较

检测2个体系75和90 d在蕾、花、花药中nptⅡ基因的沉默效率，比较2个体系在棉花不同发育部位对目的基因沉默效率的差异。TRV体系中只有蕾中的nptⅡ基因表达量被较少的抑制(图6)，75、90 d的沉默效率分别为12 %和11 %，而棉花其它生殖器官发育部位基本不能诱导目的基因的沉默。CLCrV体系75和90 d在蕾中对nptⅡ基因的沉默效率分别为63 %和61 %，花中的沉默效率分别为46 %和51 %，花药中的沉默效率分别为38 %和33 %，说明与TRV载体相比，CLCrV载体能够在棉花蕾、花、花药等生殖器官发育部位诱导目的基因的沉默。

3 讨 论

VIGS 技术具有操作迅速、简单、成本低，使用较小的片段达到较高的沉默效果以及短期内能够观察到基因沉默后表型变化等的特点，特别适用于像棉花这样的生长周期长、遗传转化过程费力耗时，基因组功能冗余的植物，因此被广泛地应用于棉花基因功能的研究[11-13]。王心宇等[14]通过在棉花中建立TRV病毒诱导的基因沉默体系，抑制了棉花中GhMAPKKK基因的表达，使得抑制后的棉花植株接种黄萎病菌后更易感病，验证了GhMAPKKK基因参与棉花对黄萎病菌的抗性反应的基因功能。VIGS病毒载体的选择作为试验的重要步骤，决定着试验成功的关键。在验证棉花中相关基因功能的研究中，前人选择TRV病毒作为VIGS技术载体，验证TRV-VIGS体系在不同棉种中的侵染效果和侵染部位；使用CLCrV作为VIGS技术载体，研究该病毒载体在棉花VIGS技术中建立和适用性[15-17]。本研究基于2种病毒载体构建了TRV-VIGS和CLCrV-VIGS2种体系，在同一棉花品种中验证2种体系目的基因在棉花叶片中的沉默效率、沉默时间的差异以及棉花生殖器官中的沉默效率差异。

本研究构建了基于TRV病毒载体和CLCrV病毒载体的2种VIGS病毒沉默体系，成功侵染棉花后，TRV体系与CLCrV体系在不同发育时期叶片中相对表达量的比较，证明TRV病毒在棉花VIGS技术里是沉默效率较高的病毒载体，但持续时间较CLCrV体系短，且生长发育后期沉默效率逐渐降低。CLCrV体系基因沉默效率虽比TRV体系略低，但沉默效率较稳定、持久，能够作用于棉花植株生长发育的整个阶段。比较TRV体系与CLCrV体系在不同生殖器官中的相对表达量，TRV体系在棉花生殖器官中的沉默效果不明显，而CLCrV体系有较好的沉默效果，可作用于棉花蕾、花、花药等部位，表明在研究棉花蕾、花、花药等生殖器官中的基因功能时，可选用CLCrV介导的基因沉默表达载体。

4 结 论

TRV病毒沉默体系主要适用于接菌后短期内棉花内源基因的沉默，适用于抗逆基因的功能验证；CLCrV病毒沉默体系适用于棉花生长发育过程中起长期作用基因的沉默，可以研究生殖生长相关的基因的功能。现阶段已通过VIGS技术在棉花中成功鉴定出许多基因功能，为棉花的分子育种提供有价值的基因资源，本研究为验证棉花中不同时期不同部位基因功能选择不同VIGS载体提供理论参考，对研究棉花基因功能乃至基因工程具有重要意义。