镉胁迫处理对水培苦苣幼苗生理响应及叶片超微结构的影响

朱润华，贺忠群，王海霞，白 胜，阳圣莹，蒋浩宏

(1.四川省农业科学院服务中心,四川 成都 610066;2.四川农业大学 园艺学院,四川 成都 611130)

【研究意义】近年来，日益严重的重金属污染问题亟待解决，其中镉(Cd)因其高污染和可迁移性，越来越受到关注,同时镉对多数有机体有毒害作用，并会随着食物链进入人体，危害人类健康[1-2]。【前人研究进展】金利坚等[3]抽取的四川省21个市州993分样品中，土壤镉含量超标样品占56.90%。当植物在受到高质量浓度镉胁迫后，会出现生长抑制，株高、鲜重下降、叶片萎黄等现象，同时细胞质膜的组分、结构及选择透性也受到影响，导致植物细胞损伤并影响其生理代谢，严重时造成植物死亡[4-6]。【本研究切入点】苦苣(CichoriumendiviaL.)是菊科一二年生草本植物，又名苦菊、苦菜，其资源分布较为广泛[7-9]，是人们喜食的鲜食蔬菜。但目前缺乏关于苦苣镉胁迫的生理过程研究，其对重金属的耐受差异性也缺乏研究支持。水培技术是无土栽培技术中应用较为广泛的一种，采用水培方法生产苦苣，可以有效地了解和调控苦苣的生长环境，也可以更好的了解各种元素对于苦苣生长的影响。【拟解决的关键问题】苦苣在已知的生产栽培中表现出了较强的适应性，研究镉胁迫条件下苦苣的生长及生理特性的变化，以及镉胁迫下水培苦苣叶片的超显微结构变化，可为以后苦苣的推广种植以及重金属积累研究等方面提供参考建议。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验的植物材料为花叶苦苣(CichoriumendiviaL.)，由北京东升种业有限公司提供。

在原霍格兰氏营养液基础上进行调整，其中A母液含四水硝酸钙70.8 g/L、硝酸钾80.8 g/L；B母液含磷酸氢二铵15.4 g/L、七水硫酸镁49.2 g/L；C母液含EDTA铁钠盐50 g/L、硼酸4.26 g/L、四水硫酸锰5.72 g/L、七水硫酸锌0.44 g/L、五水硫酸铜0.16 g/L、四水钼酸铵0.04 g/L。水培苦苣每3 d补充1次营养液，每次0.5 L。

1.2 试验方法

试验2020年3月至4月在四川省农业科学院服务中心农业工程研究中心植物工厂内进行，采取半封闭管理。光源采用三基色荧光灯，光谱如图1所示。每天光照12 h(7:00-19:00)室内，温度20 ℃。 苦苣种子在催芽箱中露白出芽后，定植于水培槽(规格为40 cm×30 cm×5 cm)中，每个水培槽中种植120株苦苣幼苗，如未成功定植及时补苗。

图1 植物工厂人工光源光谱

所有幼苗出现5片真叶后进行镉胁迫。在水培槽中添加含有不同浓度氯化镉的营养液0.5 L。营养液浓度分别设置为0 mg/L氯化镉(CK)，0.5 mg/L氯化镉(A1)，1 mg/L氯化镉(A2)，5 mg/L氯化镉(A3)，10 mg/L氯化镉(A4)。A1为低浓度镉处理，A4为镉高浓度处理。每个处理3次重复,共15个水培槽。到30 d时添加的营养液不再含氯化镉。

1.3 指标测定

在处理30 d时进行生长指标的测定:株高、地上部分鲜重，水培苦苣幼苗致死率(%)=死亡株数/总株数×100%[10],均取平均值。

镉胁迫3 d时测定地上部分镉含量[11]；叶片丙二醛(MDA)测定参考熊庆娥[12]的方法；游离脯氨酸测定采用酸性茚三酮比色法；SOD活性测定参考李合生[13]的方法；POD性测定参考王学奎[14]的方法；叶绿素含量测定参考LICHTENT-HALER等[15]的方法。

1.4 叶片超微结构的观察

处理3 d时，将地上部分嫩叶送四川大学电镜室用透射电镜观察其超微结构变化。

1.5 数据分析

用Excel对试验数据进行统计分析，用SPSS 软件(新复极差法)对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫处理对水培苦苣镉积累的影响

由表1可知，镉胁迫3 d时，A4处理苦苣镉含量超过国家食品安全标准[16]，CK处理的镉含量小于或等于国家标准限定量，故未标注具体数值。

表1 镉胁迫3 d时苦苣幼苗的总镉含量

2.2 镉胁迫对水培苦苣幼苗生长的影响

2.2.1 镉胁迫对苦苣幼苗致死率、地上部分鲜重和株高的影响 镉处理使苦苣幼苗的死亡率显著提高(表2)随着营养液中镉浓度增高，处理30 d时苦苣幼苗死亡率也随之升高。与对照相比，A1和A4处理的苦苣幼苗死亡率分别提高了166.80%和933.20%。

表2 镉胁迫对苦苣幼苗死亡率、鲜重和株高的影响

镉胁迫30 d时，处理组与CK组相比，苦苣幼苗地上部分鲜重和株高显著降低。随着营养液中镉浓度的增加，苦苣幼苗地上部分的鲜重和株高均呈现下降趋势。与CK相比，A4处理苦苣幼苗地上部分平均鲜重下降35.55%，株高下降22.19%。

2.3 镉胁迫对水培苦苣幼苗叶绿素及类胡萝卜素的影响

随着镉浓度升高，苦苣幼苗叶片内的叶绿素a、

叶绿素b、总叶绿素含量均表现为先升高后下降的变化趋势(表3)。A3处理苦苣幼苗叶片总叶绿素含量最大，与CK相比，A3处理叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别提高26.15%、26.27%和26.18%。A4处理与A3处理相比，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别下降5.24%、4.55%和4.97%。类胡萝卜素含量随着营养液中镉浓度增大表现出逐渐升高的变化趋势，A4处理苦苣幼苗叶片类胡萝卜素含量含量达到最大值，相比CK处理提高23.36%。所有处理水培苦苣幼苗的类胡萝卜素的含量均远高于总叶绿素含量。

表3 镉胁迫对苦苣幼苗叶片总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量及类胡萝卜素的影响

2.4 镉胁迫对苦苣幼苗游离脯氨酸含量和丙二醛的影响

随着镉浓度升高，苦苣幼苗叶片游离脯氨酸含量总体表现为先升高后降低的变化趋势(表4)。与CK相比，A1处理的脯氨酸含量显著提高，升高25.45%，A4处理比A1处理苦苣幼苗体内游离脯氨酸含量下降19.42%，但还是略高于CK处理。随着镉浓度升高，苦苣幼苗叶片丙二醛(MDA)含量总体表现为先升高后降低的趋势。与CK相比，A1处理的丙二醛含量显著增加，相比CK提升14.00%，而含量最低为A4处理，较A1处理苦苣幼苗体内游离脯氨酸含量下降11.25%。

表4 镉胁迫对苦苣幼苗叶片游离脯氨酸和丙二醛含量的影响

2.5 镉胁迫对叶片超氧化歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶POD的影响

随着镉浓度升高，镉处理使苦苣幼苗叶片内的SOD活性呈现逐渐下降的趋势(表5)，A1、A2、A3、A4处理中SOD活性相比于CK处理显著下降，下降幅度分别为53.08%、57.25%、78.66%和88.61%。A1和A2处理与CK相比，SOD活性表现为降低，但两组处理间没有显著性差异。处理A3和A4的SOD活性下降幅度与营养液氯化镉浓度表现为负相关性。苦苣幼苗叶片内的POD活性也呈现先下降后上升的趋势，处理A1相比CK处理下降3.10%，A2处理POD活性最低，比CK降低11%，POD活性最高为A4处理，较CK升高27%。

表5 镉胁迫对苦苣幼苗叶片超氧化歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性含量的影响

2.6 镉胁迫对水培苦苣幼苗叶片超微结构的影响

2.6.1 镉胁迫对苦苣幼苗叶绿体形态及分布的影响 CK处理苦苣幼苗的叶绿体与细胞膜贴合均匀紧密(图2)，叶绿体形态狭长扁平，内外膜结构完整，有利于最大程度接受光能；随着镉处理浓度增加，叶片内的叶绿体与细胞膜之间紧贴程度下降，逐渐脱离细胞膜或与细胞膜贴合出现空隙，在细胞质中扎堆分布，叶绿体形态发生不同程度的肿胀，且随着总镉含量增加，叶绿体肿胀变形程度也逐渐增加。

a：叶绿体；b：基粒片层；c：淀粉粒；d：嗜锇颗粒

2.6.2 镉胁迫对苦苣幼苗叶绿体内淀粉粒的影响 CK处理苦苣幼苗叶片的叶绿体内淀粉粒体积较小且含量较少，多数叶绿体内观察不到淀粉粒；随着营养液中氯化镉浓度的增加，从A1处理开始，苦苣幼苗叶片的叶绿体内淀粉粒数量增加，但体积依旧较小；在A2和A3处理中，苦苣幼苗叶片的叶绿体内的淀粉粒迅速增大，在叶绿体中占据较大体积；与CK处理与A1处理相比，A4处理苦苣幼苗叶片几乎所有叶绿体均含有淀粉粒，叶片叶绿体中淀粉粒大量增加且体积较大。

2.6.3 镉胁迫对苦苣幼苗叶绿体内嗜锇颗粒的影响 CK、A1、A2处理下，苦苣幼苗叶绿体内的嗜锇颗粒体积都相对较小，数量也较少；A3处理中苦苣幼苗叶绿体内的嗜锇颗粒数量相对较少，但与其他处理相比体积明显增大；A4处理中，嗜锇颗粒体积较小，数量较适中。

2.6.4 镉胁迫对苦苣幼苗基粒的影响 在CK、A1处理中生长的苦苣幼苗，叶绿体内部基粒和基质类囊体排列较为有序，片层结构规则，没有出现明显变形，片层之间也未出现明显间隙。随着苦苣幼苗体内总镉含量的增加，苦苣幼苗叶绿体基粒片层之间出现了明显的间隙，基粒垛叠结构变得模糊，片层发生断裂，部分类囊体膜糊不清，类囊体之间出现扭曲或者膨胀，在A4处理中最为明显。

3 讨 论

叶绿素是光合作用中最重要的色素，在接受、传递、转化光能上发挥着不可替代的作用，其含量的高低与光合作用密切相关[17]。本研究结果显示，镉胁迫下叶绿素含量整体表现为先升高后降低的变化趋势，可能是因为低浓度镉刺激叶绿素合成，进而维持光合作用，而随着苦苣幼苗体内总镉含量的增加，胁迫程度超过叶绿素合成速度的极限，同时产生了大量的活性氧自由基，对叶绿素被膜产生过氧化作用，导致叶绿素降解。

类胡萝卜素是主要位于光合与非光合植物质体中的脂溶性抗氧化剂[18]，可以清除植物体内的自由基，防止膜脂质过氧化，稳定膜脂质双分子层[19]。类胡萝卜素也是构成植物叶、花和果实颜色的重要成分之一[20]。本研究发现，随着苦苣幼苗体内总镉含量的增加，类胡萝卜素含量趋势表现为逐渐增加。在植物体内，类胡萝卜素能够防止光氧化产生的破坏作用并协助叶绿素吸收光能，但正常情况下叶片中叶绿素含量均高于类胡萝卜素含量，本试验中类胡萝卜素含量却远高于叶绿素，可能由以下三个原因导致：一是由于苦苣幼苗通过增加类胡萝卜素含量加强清除活性氧的能力；二是由于类胡萝卜素组成复杂，对镉的敏感程度小于叶绿素，与朱喜锋等[21]的研究结果一致，Cd2+通过损害光合作用器官、结合生物大分子的活性位点(如Cd2+取代叶绿素分子中心的Mg2+从而破坏叶绿素结构)影响光合作用；三是由于植物工厂人工光源的光照强度过高，类胡萝卜素基于调节吸收过剩光能的作用，植物自身适应性调节，进而积累了较多的类胡萝卜素。

植物的质膜透性变化和渗透调节相关研究在植物逆境反应研究中较为普遍。本研究表明，镉胁迫对苦苣幼苗渗透作用相关调节物质和质膜透性变化的影响是基本一致的。游离脯氨酸作为重要渗透保护剂，在各个生理逆境中均表现了游离脯氨酸的积累[22]。其主要作用在于保持细胞内外水分平衡、调节细胞内外渗透势，对维持细胞内相关代谢功能的正常进行具有重要意义[23]。丙二醛(MDA)是植物遭受逆境胁迫程度高低的重要指标[24]，其含量的变化可以反映出质膜透性变化所导致的电解质外渗，了解细胞膜脂的过氧化程度。在低浓度镉胁迫时，苦苣幼苗自身的渗透调节和质膜透性就开始产生变化，游离脯氨酸含量与丙二醛含量整体均表现为先上升后下降的趋势。随着镉浓度增加，胁迫程度超过苦苣幼苗自身调节作用的极限，相关渗透调解物质含量下降，进而对植物细胞造成伤害。

重金属离子对植物地上部分的影响也存在于呼吸作用中，杨树华等[25]研究表明，水稻种子萌发时的呼吸强度随铅离子浓度增加而降低，呈显著负相关性。低浓度镉刺激植物呼吸酶以产生能量是呼吸增加的原因，随镉浓度增加酶活性受抑制呼吸作用下降[26]。当植物遭遇逆境胁迫时，体内自由基(ROS)、活性氧积累量提升，抗氧化酶活性在自身调节作用下也会相应提高。但本试验中，随着营养液中添加氯化镉溶液浓度的增加，苦苣幼苗内SOD酶活性表现为逐渐降低。在A1处理下，低浓度镉造成的胁迫程度较轻，而SOD酶活性相较于空白组依旧下降了53%，可能是由于镉直接作用在SOD酶合成的代谢通路上，进而降低了苦苣幼苗体内SOD酶的活性。SOD酶可以将自由基、活性氧转化为无害的水与氧气，进而间接降低重金属离子对植株的伤害，本试验中水培苦苣幼苗在吸收镉后，无法正常清除自由基、活性氧等超氧阴离子，进而也间接解释了30 d时高浓度镉溶液处理导致苦苣幼苗的高致死率和在处理3 d时幼苗体内总镉含量累积较快的原因。

SOD等抗氧化关键酶在清除调节植株体内的活性氧，抵御、减轻活性氧造成的伤害上起重要作用。SOD能够将超氧阴离子歧化为过氧化氢(H2O2)，缓解超氧阴离子对植株的毒害作用[27]，POD能够清除不同细胞位置的H2O2，使之转化为H2O[28]。POD酶活性的变化没有SOD剧烈,且表现为先下降后上升的趋势，在A2处理到达最低值，说明苦苣幼苗在受到镉胁迫时，有些抗氧化酶活性受到抑制，但整个酶保护系统还是起到了一定缓解自由基危害的作用，使其他酶活性升高，一定程度上缓解了镉胁迫下活性氧自由基对膜质的损伤，并对植株的正常生长造成了一定的影响。该结果可能是因为镉虽然影响了氧化酶的合成途径，但是随着镉浓度的增加，对酚类物质的代谢起到了部分刺激作用，才使得POD酶的活性随之增高。

对苦苣幼苗叶片的超显微结构进行观察发现, A1处理中,叶绿体沿细胞膜均匀分布且可以紧贴细胞膜。内部结构较为完整,基粒片层结构规则有序，基质类囊体结构清晰,有利于光能的接收、利用、转化。随着镉胁迫程度的增加,叶绿体分布不再均匀沿着细胞膜,在细胞质中出现部分扎堆聚集的现象。叶绿体外背膜不再光滑清晰,基粒膨胀且排布开始混乱，基粒片层间出现明显间隙,部分类囊体变得膜糊不清,造成的原因可能是镉直接破坏叶绿体的膜结构或者细胞质膜，进而造成叶绿体变形失活；镉胁迫阻碍了淀粉的水解和向外运输，使得叶绿体内出现较大体积淀粉粒，与孔维萍等[29]研究结果相似；镉阻碍了叶绿体光合电子传递,使光化学活性降低；亦或者是由于无法及时清除活性氧自由基，进而造成叶绿体结构和功能的破坏。随着苦苣幼苗体内镉积累量的增加，叶绿体与细胞膜之间的空隙也在增加，说明在较高浓度镉胁迫下，重金属离子会越来越多的沉积在细胞膜表面，而植株通过自身调节，使叶绿体脱离细胞膜，进而缓解镉胁迫对细胞功能带来的损伤。另外，苦苣幼苗对嗜锇颗粒不敏感，随着镉胁迫程度的增加，嗜锇颗粒数量的累计与体积大小并没有相关性变化。

4 结 论

镉积累对苦苣幼苗植株生长及叶片细胞超微结构均造成了较大影响。在镉胁迫下，苦苣幼苗通过自身调节叶绿素和类胡萝卜素的含量，改变质膜透性和渗透调节作用，提高了植株对镉胁迫的适应性。所以苦苣对镉具有一定的耐性，但过量的镉会破坏苦苣的部分酶(超氧化歧化酶、过氧化物酶)活性，引起自身调节功能紊乱和代谢异常。此外，随着镉胁迫程度的增加，苦苣幼苗叶绿体结构变化较大、功能遭到破坏，进而影响植株整体的生长。因此，本研究结果对以后更加研究深入地研究重金属胁迫对苦苣幼苗形态结构、逆境应答的影响具有重要意义。