香菇多糖抗小鼠MRSA皮肤感染的作用

蒋苗苗，李雪飞，唐冠杰，轩玉宏，段昕所，孙立新

（1.承德医学院附属医院，河北承德 067000；2.承德市中心医院）

香菇多糖是从伞菌科真菌香菇的子实体中分离到的一种β-1,3-葡聚糖，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫感染等作用[1]。金黄色葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，是引起院内感染的重要致病菌。近年来，由于抗生素的滥用，导致多重耐药性金黄色葡萄球菌产生，其致病性不断提高，病死率逐年增加。本研究通过建立小鼠皮肤感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S.aureus，MRSA）的模型，观察香菇多糖是否有抗MRSA皮肤感染的作用。

1 材料

1.1 主要试剂与仪器

香菇多糖20mg，棕黄褐色粉末，批号：A0212A，购自大连美仑生物技术有限公司。TRIZOL（INVITORGEN）试剂盒、RevertAid first cDNA synthesis（MBI）购自美国Thermo公司，Taq酶、Marker购自北京庄盟生物有限公司，Anti-Neutrophil CD11b抗体、Anti-Neutrophil Gr-1抗体购自美国Abcam公司。PCR扩增仪（上海透景生命科技股份有限公司）；CK40-F200型相差倒置显微镜（Olympus，日本）；MCO-15AC型C02恒温培养箱（SANYO，日本）。

1.2 动物

BALB/C近交系小鼠，体重18～22g，6～8周龄，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号：SCXK（京）20160006，合格证号：11400700302051。

1.3 细菌

MRSA菌株由本实验室-80°冻存。

2 方法

2.1 小鼠皮肤感染模型的建立

培养MRSA，选择正常6～8周龄、体重18～22g雄性BALB/C小鼠，设立对照组和香菇多糖处理组，随机分组，每组10只。腹腔注射0.4%戊巴比妥钠（50mg/kg）进行麻醉，麻醉成功后用剃毛器剃去小鼠背部毛发，皮下注射5×107菌落形成单位（colony-forming units，CFU）/ml MRSA 30μl，建立皮肤感染模型。

2.2 给药方法

对照组连续5d腹腔注射100μl PBS，实验组连续5d腹腔注射浓度为100mg/kg的香菇多糖100μl。

2.3 观察感染情况

分别于感染第1天、第3天、第5天，观察香菇多糖处理组与PBS空白对照组的小鼠皮肤部位感染情况。

2.4 细菌培养检测

取小鼠皮肤感染部位组织，无菌玻璃匀浆器匀浆，稀释后取100μl均匀涂于LB培养板，于37℃培养箱中培养24h后，统计CFU。

2.5 RT-PCR法检测

采用RT-PCR法检测白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）mRNA、中性粒细胞趋化因子1（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，KC）mRNA[2]。引物序列：IL-33上游引物5’-CCTGCCTCCCCTGAGTACATACA-3’下游引物为5’-CTTCTTCCCATCCACACCGT-3’。KC上游引物为5’-CACGTGTTGACGCTTCCCTT-3’，下游引物为5’-TGAACGTCTCTGTCCCGAGC-3’，Trizol提取细胞总RNA并逆转录成cDNA，进行PCR反应。以IL-33 mRNA、KC mRNA条带与β-actin条带灰度值的比值作为IL-33 mRNA、KC mRNA的相对表达水平。每组实验重复3次。

2.6 免疫荧光染色方法检测

免疫荧光染色方法检测小鼠皮肤感染部位内中性粒细胞浸润情况，50～60 ℃烤片，放入二甲苯Ⅰ液、Ⅱ液，不同浓度乙醇及蒸馏水Ⅰ液、Ⅱ液脱蜡至水，抗原修复缓冲液中进行抗原修复，分别加一抗（anti-neutrophil CD11b抗体、anti-neutrophil Gr-1抗体）4℃过夜，分别加（1：500）稀释的二抗，加DAPI染核室温孵育，抗荧光淬灭封片，荧光显微镜下观察并拍照。

2.7 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据处理，实验数据用平均数与标准差（mean±SD）表示。数据进行t检验分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 观察感染情况

感染后第3天，PBS空白对照小鼠皮肤感染部位发生溃疡，有脓苔；第5天时溃疡进一步增大，脓苔增多，而香菇多糖处理组小鼠皮肤感染部位在相同时间仅有局部皮肤发红，感染症状明显轻于对照组（图1）。

图1 小鼠皮肤感染部位感染情况

3.2 细菌培养检测

感染后第5天，小鼠皮肤感染部位细菌负荷量香菇多糖处理组明显低于空白对照组（图2），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 小鼠皮肤感染部位细菌负荷量

3.3 RT-PCR法检测

感染后第5天，对小鼠皮肤感染部位IL-33 mRNA、趋化因子KC mRNA的表达作比较，香菇多糖处理组明显高于空白对照组（图3），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 小鼠皮肤感染部位IL-33 mRNA、趋化因子KC mRNA表达

3.4 免疫荧光染色检测

感染后第5天，小鼠皮肤感染部位CD11b、Gr-1（中性粒细胞标记）阳性细胞香菇多糖处理组明显高于空白对照组（图4，5），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 小鼠皮肤感染部位中性粒细胞浸润情况

图5 免疫荧光染色检测小鼠皮肤感染部位中性粒细胞浸润情况

4 讨论

根据中国细菌耐药监测网的监测数据显示，2017年我国综合性医院检出的MRSA在所有金黄色葡萄球菌感染中的占比约为35.30%，且对临床常见抗菌药的耐药性均在50.00%以上[2]。MRSA的感染几乎遍布世界各地，其病死率增高[3]，现已成为全球治疗的难题[4]，其侵袭的部位以皮肤和软组织最为常见。为此本课题通过建立小鼠皮肤感染MRSA的模型，采用具有抗细菌感染作用的香菇多糖进行治疗，并设PBS空白对照，观察小鼠皮肤感染部位，通过细菌培养检测感染部位细菌负荷量。结果发现香菇多糖处理组感染症状在相同时间明显轻于PBS空白对照组，且感染第5天小鼠皮肤感染部位细菌负荷量香菇多糖处理组明显低于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明香菇多糖具有抗小鼠MRSA皮肤感染的作用。

为了进一步明确香菇多糖抗小鼠MRSA皮肤感染的作用机制，我们通过检测感染第5天小鼠皮肤感染部位CD11b、Gr-1（中性粒细胞标记）阳性细胞，发现香菇多糖处理组明显高于空白对照组；同时感染部位IL-33 mRNA、趋化因子KC mRNA的表达明显高于对照组。中性粒细胞是先天免疫的重要组成部分，在控制细菌感染中发挥关键作用[5-7]，中性粒细迁移到感染部位主要依赖于趋化因子KC等。有研究发现，IL-33能促进中性粒细胞从外周血迁移至炎症部位，加强对病原体的清除[8,9]。本实验通过检测小鼠皮肤感染部位中性粒细胞浸润情况及IL-33 mRNA、趋化因子KC mRNA表达，提示香菇多糖可能通过调节中性粒细胞发挥抗MRSA感染的作用。

香菇含有多种成分，其中香菇多糖-β-葡聚糖为其具有生物活性的主要成分[10]。研究表明，β-葡聚糖是机体获得性免疫和天然免疫的重要生物效应调节剂之一[11]，在抗菌反应中起重要作用[12-15]，然而对于其是否可以抗MRSA对小鼠皮肤部位的感染，目前还没有相关研究报道。本研究通过对小鼠皮肤部位感染情况、细菌负荷量、IL-33、趋化因子KC等指标进行检测，为香菇多糖的抗感染作用提供了新证据，并使我们对香菇多糖的抗菌作用机制有了更深入的了解。尤其是为抗MRSA感染药物的选择提供了新思路，为应用香菇多糖进行抗菌治疗提供了一定的理论依据。