ULK1启动子区含有抑制ULK1转录的G4结构*

刘雪萍， 黄伟伟， 李晓梅

（西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100）

自噬（autophagy）是真核生物中广泛存在的依赖溶酶体的细胞内降解途径，对维持细胞内稳态和保证细胞生命活动有序进行有重要作用。目前已发现超过30 种自噬相关基因（autophagy-related genes，ATG），ATG 蛋白及多条上游信号在各个阶段参与调控自噬。UNC-51 样激酶 1（ULK-51-like kinase 1，ULK1）作为酵母Atg1基因在哺乳动物中的同源基因，其蛋白是自噬起始步骤的主要调控子［1］。ULK1参与形成的ULK1 复合物是细胞自噬起始所必需的［2］。另外，ULK1 参与形成前自噬体的核心结构［3］。因此，ULK1是自噬起始过程中不可缺少的成分。

ULK1 参与调控大量下游自噬相关通路。在ULK1敲除研究中，小鼠因缺乏ULK1而自噬功能受到强烈抑制［4］。除了参与调控经典的自噬相关通路，ULK1 还参与一些非经典信号通路的调节，例如特殊压力刺激导致的自噬，线粒体自噬等［5］。ULK1广泛存在于人体各种组织中，与正常组织不同的是ULK1在各种肿瘤细胞中表达变化很大，其参与多种恶性肿瘤的发生发展过程并扮演不同角色［6］，Zhang等［7］发现，在雄激素阻断治疗后发生肿瘤转移的前列腺癌患者中，ULK1的高表达可作为转移性前列腺癌的有效标志物。目前对于ULK1 的表达调控研究国内外仅有少量文献报道。Mukesh 等［8］发现ULK1结构域中超过50%的突变会影响其功能和结构稳定性。此外，王焕等［9］发现RAD001 能显著上调子宫内膜癌Ishikawa 及HEC-1A 细胞中ULK1蛋白的表达水平。本研究拟对ULK1的转录表达调控进行研究，通过分析ULK1启动子序列，发现其中存在G 四联体（G-quadruplex，G4）形成序列，提示ULK1启动子区可能形成G4并调控ULK1的转录表达。G4是一类由富含连续鸟嘌呤的DNA 序列形成的四链螺旋结构，广泛分布于基因组的许多重要区域，对DNA 复制、基因转录与翻译和端粒代谢等多种细胞代谢产生重要影响。目前在多个基因的启动子区已发现G4，它参与转录激活或沉默基因表达，如c-myc［10］和c-KIT［11］等。G4 广泛参与基因的表达调控且与细胞衰老、凋亡和肿瘤的发生发展及一些其他疾病相关。正是由于G4在细胞内重要的生物学功能，近年来G4研究受到广泛关注。因此，本研究对ULK1启动子区是否形成G4，以及G4 对ULK1的转录调控作用进行研究，为揭示ULK1的转录调控机制提供新的线索。

材料和方法

1 细胞

人前列腺癌细胞系DU-145 购自北京协和医科大学基础医学细胞中心，用含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素的 RPMI-1640 培养基置于5%二氧化碳、37 ℃培养箱中静置培养，及时换液、传代，保持细胞生长状态良好。

2 主要试剂

DNA 寡核苷酸和引物由Invitrogen 合成；RPMI-1640 培养基和Opti-MEM 购自Gibco；胎牛血清（900108）购自Gemini；限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶购自NEB；Lipofectamine® 2000 Reagent 购自Invitrogen；RNAex Pro RNA 提取试剂（AG21102）、Evo M-MLV 反转录试剂盒（AG11705）和SYBR Green Pro Taq HS 预混型PCR 试剂盒（AG11701）均购自艾科瑞生物公司；β-actin 抗体（AA128）、RIPA 裂解液（P0013B）、胰酶（C0201）和青霉素-链霉素溶液（C0222）均购自碧云天生物技术公司；ULK1 抗体（8054S）购自CST；HRP 标记的山羊抗鼠（L3032）和山羊抗兔（L3012）Ⅱ抗购自SAB；ECL 显色液（170-5061）购自Bio-Rad；质粒小提试剂盒（D6943-01）和胶回收试剂盒（D2500-01）购自Omega；BCA 试剂盒（CW0014S）购自北京康为世纪；TMPyP4（A5014-100MG）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；PDS（A3742）购自上海伟寰生物科技有限公司。

3 方法

3.1 质粒构建 设计合成特异性ULK1启动子PCR引物（见表1），分别引入EcoR I 和Hind Ⅲ酶切位点，以HeLa 细胞基因组DNA 为模板，扩增ULK1启动子序列，插入经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切的pGLuc-Basic载体中，以构建野生型ULK1启动子报告基因质粒。

表1 PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for PCR

3.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE） 用含有 100 mmol/L LiCl 或 KCl 的 Tris-HCl（10 mmol/L，pH 8.0）将寡核苷酸稀释至50 μmol/L，沸水浴退火5 min，缓慢冷却至室温。退火样品经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶在0.5×TBE 中以100 V 恒压电泳1.5 h。对凝胶进行DNA 银染，每次更换溶液时佩戴一次性PE 手套，避免接触凝胶，最后用扫描仪扫描拍照。

3.3 圆二色谱（circular dichroism，CD）分析 取20 μL 合成的寡核苷酸（100 μmol/L）和180 μL Tris-HCl（10 mmol/L，pH 8.0），混匀后置于PCR 仪按照Huang等［12］报道的程序退火，退火后的寡核苷酸用含有同等浓度阳离子的 Tris-HCl 稀释至 500 μL，获得 CD 样品，用0.5 mm 的石英杯进行检测，程序设置：波长200～350 nm，温度25 ℃。以被证实能够形成G4 的人c-Myc 启动子区序列Pu27（5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG-3'）为阳性对照，以突变后不能形成G4 的端粒3’端简单序列Tel-MUT（5'-AGAGTTTAGAGTTTAGAGTTTAGAG-3'）为 阴 性 对照［13］。以摩尔椭圆度为纵坐标，波长为横坐标做图，减去背景值绘制光谱图，根据不同波长下的摩尔椭圆率来鉴定各序列是否形成G4。

3.4 萤光素酶报告基因检测 将生长状态良好的DU-145细胞以适当比例接种至24孔板过夜培养，次日用Lipofectamine 2000 按照使用说明进行转染，报告质粒转染量为每孔200 ng，参照质粒pCMV-SEAP的量为每孔5 ng，转染前将RPMI-1640完全培养基更换为Opti-MEM，转染6～8 h 后更换为完全培养基。转染48 h 后收集培养基，分别测定GLuc 和SEAP 活性，每个样品重复测定3 次，计算相对GLuc 活性，结果取平均值。

3.5 RT-qPCR 将生长状态良好的DU-145 细胞以适当比例接种至3.5 cm 培养皿过夜培养，次日用不同终浓度的 TMPyP4 处理，48 h 后弃培养液，PBS 洗涤2 次，加入1 mL Trizol 反复吹打，待溶液变粘稠透明将其转移至无菌无酶的离心管。参照提取试剂说明提取总 RNA。取1 μg 总RNA 反转录为 cDNA，按照试剂说明配制25 μL反应体系，所用引物序列见表1。每个样品设置3 个重复，β-actin 为内参照，按照试剂盒说明程序进行。使用Bio-Rad CFX Manager V1.1.308.1111 软件采用 2-ΔΔCt法进行数据分析，计算靶基因的相对表达量。实验至少重复3 次，结果取平均值。

3.6 Western blot 实验 取生长状态良好的DU-145细胞以适当比例接种至12 孔板过夜培养，次日用不同终浓度的TMPyP4 处理细胞，48 h 后收集细胞。根据收集细胞量的大小加入适量含有PMSF 和蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，用超声破碎仪裂解细胞，4 ℃，14 000 r/min离心15 min，取总蛋白上清液，测定蛋白浓度，将所有蛋白样品调至同一浓度，加入5×SDS Loading Buffer，混匀后沸水浴5 min。获得的蛋白样品直接用于SDS-PAGE 或-20 ℃冻存。分离胶浓度为8%，采用湿转法，350 mA 恒流模式下转NC膜2 h，用TBST 配制的5%脱脂牛奶室温封闭1 h，Ⅰ抗用Ⅰ抗稀释液以1∶1 000 的比例稀释，4 ℃过夜孵育，次日用TBST 洗膜洗膜3 次，每次6 min，Ⅱ抗用5%脱脂牛奶以1∶5 000 的比例稀释，室温孵育1 h，再次洗膜后用ECL 发光液均匀覆盖NC 膜上目的蛋白所在区域，利用化学发光成像仪曝光，β-actin 为内参照，用Image Lab软件处理分析实验结果。

4 统计学处理

利用Graph Pad Prism 8.0.1 进行数据分析和制图。实验数据采用均数±标准差（mean±SD）表示，利用Student-T Test 检测数据之间的差异显著性，P＜0.05为差异有显著性。

结 果

1 ULK1启动子区含有富G/C区并形成G4结构

分析ULK1 启动子序列，发现ULK1转录起始点上游1 000 bp 的G/C 含量较高，转录起始点上游276～120 bp 的 C 含量为 61.5%，626 bp～358 bp 的 G 含量为63.6%，见图1A，ULK1 启动子富G/C 的区域可能形成G4。设计引物（见表1）分别扩增富G 序列（UGS）和富C 序列（UCS），在不同离子环境下退火处理，利用PAGE 检测富G/C 的序列是否形成G4，见图1B，富G/C 的序列在氯化钾溶液中，形成缓慢迁移的G4 条带，然而在没有金属阳离子存在或锂离子存在的情况下，未形成G4 条带。接下来我们研究了G4 DNA 配体 PDS（Pyridostatin）对 G4 的影响。在 DNA退火前加入不同浓度的PDS，然后检测G4 的形成，令人惊奇的是仅在 1 μmol/L PDS 存在时，G4DNA 占总DNA 的比例达到100%，表明PDS 在DNA 退火期间促进了G4的形成，见图1C。

Figure 1.The ULK1 promoter region contained rich G/C regions and formed a G4 structure.A：analysis of GC content of 1 000 bp sequence upstream of the transcription start point of ULK1 promoter；B：non-denaturing gel electrophoresis was used to detect whether G- and C-rich sequences form G4 structure.Using non-denaturing gel electrophoresis to detect whether G- and C-rich sequences form G4 structures，and G- or C-rich sequences form slow-moving G4 bands in potassium chloride solution；C：PDS promoted the formation of G4 during DNA annealing.图1 ULK1启动子区含有富G/C区并形成G4结构

2 ULK1启动子区富G/C区G4形成序列的预测

利用QGRS Mapper 对ULK1 转录起始点上游1 000 bp 序列进行分析，发现10 条可能形成G4 的序列，见图2A，分别命名为 UPG-626、UPG-596、UPG-574、UPG-539、UPG-495、UPG-400、UPC-265、UPC-240、UPC-210 和 UPC-141，其中 6 条位于正义链，4 条位于反义链，大多长度为20个碱基左右，均含有4个及以上的“GGG”，间隔少于7 个碱基且G-Score 均为65 以 上 ，其 中 UPG-400 和 UPC-210 的 G-Score 高 达106 和 107，见图 2B），提示这些序列形成 G4 的可能性极高。因此，ULK1启动子区富G/C 区极有可能形成G4。

Figure 2.Sequence prediction of G4 formation in the G/C-rich region of ULK1 promoter region.A：the online software QGRS Mapper was used to analyze the 1 000 bp promoter sequence upstream of the ULK1 transcription start point and 10 sequences that may form the G4 structure were found；B：among the 10 G4 forming sequences，6 were in the sense strand and 4 were in the antisense strand，and the G-Score scores are all above 65.图2 ULK1启动子区富G/C区G4形成序列预测

3 圆二色谱鉴定ULK1启动子区G4形成序列结构

预测发现ULK1启动子区存在10 条G4 形成序列，能否形成G4 需要进一步鉴定。圆二色谱可通过检测核酸分子的拓扑结构鉴定是否形成G4。结果显示，Tel-MUT 在何种情况下都未形成G4 特征峰。UPG-596、UPG-539、UPG-495、UPC-265、UPC-240 在K+存在的情况下，光吸收曲线趋势与Pu27 极度相似，即在240 nm 处有一负峰，在262 nm 处有一正峰，这是典型的平行G4 的偏振光吸收特征，UPG-626、UPG-574、UPG-400、UPC-210、UPC-141 的光吸收曲线显示在262 nm 处的正峰值略低于Pu27，表明上述序列在体外形成平行G4。UPG-574 除了在262 nm处出现一正峰，在295 nm 处出现第二个正峰，表明UPG-574 还可能形成反平行G4。上述结果说明ULK1启动子G4 形成序列能够在体外形成G4。见图3。

Figure 3.Circular dichroism analysis of ULK1 promoter G4 formation sequence.In any case，Tel-MUT did not form a G4 characteristic peak.In the presence of K+，the curve trends of UPG-596，UPG-539，UPG-495，UPC-265 and UPC-240 were extremely similar to Pu27，with a negative molar ellipticity peak at 240 nm and a peak at 262 nm positive molar ellipticity peak.The curves of UPG-626，UPG-574，UPG-400，UPC-210 and UPC-141 showed that the positive molar ellipticity peak at 262 nm was slightly lower than Pu27，except for UPG-574 at 262 nm a positive molar ellipticity peak appeared at，and a second positive molar ellipticity peak appeared at 295 nm.图3 圆二色谱分析ULK1启动子区G4形成序列

4 Native-PAGE 电泳鉴定 ULK1 启动子区 G4 形成序列结构

Native-PAGE 结果显示，除了明显的寡核苷酸单链线性条带（ssDNA），在不同阳离子条件下退火后，10 条序列形成了多条不同程度迁移滞后带，见图4。靠近ssDNA 条带的是分子内G4，而迁移更加滞后的是分子间G4。在50 mmol/L KCl 的退火条件下，UPG-596 和 UPG-574 没有形成靠近 ssDNA 的滞后带，说明这两条序列只能形成分子间G4，除此之外的8条序列可以形成分子间和分子内两种G4。

Figure 4.Analysis of G4 formation sequence by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.Near the singlestranded linear band was intramolecular G4，and the more lagging migration was intermolecular G4.Under the annealing condition of 50 mmol/L KCl，UPG-596 and UPG-574 did not form a hysteresis band close to ssDNA.The other eight oligonucleotides not only formed hysteresis bands close to ssDNA but also formed a more hysteretic band.图4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析G4形成序列

5 G4配体对ULK1转录的影响

TMPyP4 和 PDS 是常用的 G4 配体，能够特异结合并稳定G4。因此，借助二者研究启动子G4 对ULK1转录表达的影响。首先将ULK1启动子报告质粒转染 DU-145 细胞，24 h 后用不同浓度 TMPyP4 处理，利用报告基因检测TMPyP4 对ULK1的影响。结果发现受ULK1启动子调控的萤光素酶GLuc活性显著降低，且呈现浓度依赖性，见图5A。然后用不同浓度 TMPyP4 处理 DU-145 细胞 48 h，利用 qPCR 检测ULK1 mRNA 的水平变化。结果显示ULK1 的mRNA水平显著降低，并呈现浓度依赖性，见图5B。最后分别用不同浓度TMPyP4 和PDS 处理DU-145 细胞48 h，利用Wstern blot 检测ULK1 蛋白水平变化。结果表明二者均导致ULK1蛋白水平显著降低，并呈现浓度依赖性，见图5C。上述结果证实ULK1启动子G4对ULK1的转录表达起负调控作用。

Figure 5.The effect of G4 ligand on ULK1 transcription.A：reporter gene was used to detect the effect of TMPyP4 on ULK1 gene transcription；B：the qPCR experiment was used to detect the level of ULK1 mRNA in DU-145 cells after TMPyP4 treatment；C：Western blot was used to detect the changes of ULK1 protein levels in DU-145 cells after TMPyP4 or PDS treatment.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L.图5 G4配体对ULK1转录的影响

讨 论

自噬在肿瘤发生发展过程中显示两面性作用，ULK1作为自噬核心通路中的关键调控基因，其表达的变化与肿瘤的关系错综复杂。我们前期研究发现ULK1在前列腺肿瘤中显著高水平表达，且与肿瘤的病理分级呈正相关。因此，ULK1是一个极具吸引力的肿瘤治疗靶点，研究其表达调控有助于揭示ULK1在生理和病理过程中的作用机制。本研究首先分析了ULK1转录起始点上游1 000 bp 序列，发现富G/C区，克隆G/C 的序列后通过PAGE 和DNA 银染证明了这些序列可以形成G4；随后分析ULK1启动子富G/C 序列，预测并合成 10 条序列，通过 CD、PAGE 和DNA 银染证明在体外一定条件下ULK1启动子富G/C 区能形成G4；最后细胞试验证实启动子G4 对ULK1转录表达具有负调控作用。

大量证据表明ULK1在肿瘤的发生发展中具有调节作用，但关于ULK1自身的表达调控相对被忽略。目前有关ULK1的调控研究倾向于转录后调控以及翻译后修饰，腺苷单磷酸依赖型蛋白激酶（AMPK）磷酸化ULK1的多个位点激活其活性［14］，泛素特异性肽酶24（USP24）通过影响ULK1的泛素化和蛋白稳定性调控自噬［15］，另外，转录激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）直 接 靶 向ULK1上调其 mRNA 和蛋白表达水平而激活自噬［16］。关于ULK1启动子区的研究较为少见，目前也没有关于G4 调节ULK1表达的报道，本研究针对ULK1启动子区探讨G4 对ULK1的表达调控作用，为揭示ULK1表达调控的机制奠定实验基础。

G4 在调控基因表达方面，其作用之大不可忽视。人类基因组含有超过30 万个具有G4 形成潜力的序列［17］。著名的Wnt 信号通路控制细胞增殖、迁移及发育，Wnt 1 阳性的癌细胞具有很高的增殖能力，研究者对Wnt 1 的近端启动子进行分析，发现其启动子上游277 bp 便足以控制基因表达，该277 bp包含一段富G 区，此富G 区序列能够在体外一定条件下形成 G4 并抑制 Wnt 1 表达［18］。本研究发现ULK1 启动子也可以形成G4 并负调控其表达。这些不断被发现的G4 可能是肿肿瘤发生发展中的关键节点，是新兴的治疗靶点。如何调控G4 使其稳定或降解是当前的热点，能够直接靶向G4 的小分子引发了非常有前途的潜在疗法。一些关于使用G4 配体靶向端粒和致癌基因来治疗癌症的报道也已经出现［19］。考虑到启动子序列中的任何突变都可能改变转录因子的结合位点从而影响基因表达，我们用TMPyP4 和PDS 处理细胞以稳定G4 的方法研究G4对ULK1转录表达的影响，结果证实启动子G4 抑制ULK1表达。

总之，本研究首次发现ULK1启动子富G/C 区存在G4，细胞学检测证实G4 对ULK1转录表达有负调控作用。启动子G4 的发现为ULK1的表达和功能研究提供新的线索，为开发靶向ULK1的肿瘤治疗方案提供新的研究方向。