麦冬皂苷B通过p38信号通路诱导人骨肉瘤143B细胞凋亡*

陆建红 ， 金益军▲， 叶孝乾， 马 彦， 陈君鑫 ， 黄晓文，3△

（1海警医院检验与病理科，浙江嘉兴314000；2浙江大学医学院附属邵逸夫医院骨科，浙江杭州310020；3嘉兴市中医医院检验科，浙江嘉兴314000）

骨肉瘤是常见的恶性骨肿瘤，病情凶险，好发于儿童及青少年，多发生于肱骨与胫骨近端以及股骨远端［1］，以运动障碍、疼痛和患处肿胀为主要临床症状，且易发生肺转移，五年生存率仅70%左右［2］。传统的治疗方式为手术截肢，对患者的身心造成了极大的负面影响。近年来，尽管新辅助放化疗和介入治疗提高了保肢手术的成功率，但总体生存率仍无显著提高［3］。因此，临床诊疗工作中亟待寻求新型有效的骨肉瘤治疗方案。麦冬皂苷B 在体外能够有效促进肝癌细胞的自噬［4］，也可通过微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）调控靶基因Met进而抑制非小细胞肺癌的迁移［5］，能否作用于人骨肉瘤细胞，目前尚无文献报道。本研究通过CCK-8 实验、集落形成实验、细胞凋亡实验、Hoechst 33258 染色、细胞迁移实验及Western blot 法，探讨麦冬皂苷B 抑制人骨肉瘤143B 细胞增殖的作用机制，为骨肉瘤治疗新药的探索提供可参考的理论依据。

材料和方法

1 主要仪器和试剂

垂直电泳仪、转膜仪和Amersham Imager 600 多功能成像系统（GE）；FACScanto II 流式细胞仪（BD）；PHOmo 酶标仪（Autobio）；倒置荧光显微镜（Olympus）；细胞培养箱（Panasonic）。

麦冬皂苷B（纯度＞98%）购自南京泽朗医疗科技有限公司；CCK-8 试剂盒和Hoechst 33258 染液购自大连美仑生物技术有限公司；结晶紫染液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自BD；Transwell 小室购自Corning；抗cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK 和p-ERK 抗体均购自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 细胞培养 人骨肉瘤143B 细胞购自中国中科院细胞库，细胞培养于DMEM 高糖培养液（含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素），并于37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。

2.2 CCK-8 实验检测细胞活力 取指数生长期的143B 细胞，按每孔5 000 个细胞种植于96 孔板。待其完全贴壁后，分别加入 0、1、5、10、20、30 和 40 μmol/L 终浓度的麦冬皂苷B，每个浓度设置6 个复孔。培养48 h 后，吸去上层培养液，再加入10%的CCK-8 检测液，置于37 ℃孵育2 h，利用酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度（A）。细胞相对活力=实验组A值/对照组A值，并结合量效关系计算半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）。

2.3 集落形成实验 按每孔600 个细胞铺于6 孔板上使其成为细胞集落，待第2 天细胞贴壁后，加入相应浓度的麦冬皂苷B 处理，6 d 后用PBS 洗涤细胞，4%多聚甲醛固定20 min 后，使用0.1%的结晶紫染液染色30 min，洗涤烘干后观察各孔143B 细胞集落形成数量并拍照计数。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 用无EDTA 的胰酶消化并收集上述不同分组的细胞，以1 500 r/min离心5min，用 PBS 洗涤 3 次，并重悬于 500 μL 1×binding buffer 中，分别加入5μL annexin V-FITC 与5μL PI 染色，避光孵育25 min 后，上机测量细胞早期凋亡与晚期凋亡的百分比。

2.5 Hoechst 33258 染色 将 143B 细胞种植于 6 孔板内，待其贴壁后用不同浓度麦冬皂苷B 处理48 h，吸去培养液，PBS 轻轻洗涤2 次，加入Hoechst 33258染液染色30 min，弃去染色液，再次以PBS 洗涤后，置于荧光显微镜下观察并拍照。

2.6 细胞迁移实验 按每孔20 000 个的数量将143B 细胞铺于Transwell 小室内，同时加入不同浓度的麦冬皂苷B处理。培养板小室内加入200 μL不含血清的DMEM 高糖培养液，下室内加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，并放置于细胞培养箱内培养。48 h 后用PBS 洗涤培养板，加入0.1%的结晶紫染液染色30 min，用PBS 洗涤后在显微镜下观察并拍照。

2.7 Western blot 检测蛋白水平 143B 细胞经不同浓度麦冬皂苷B 和相应抑制剂处理后，加入RIPA 裂解液（含有1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂），并于超声波仪中裂解，定量后调齐内参上样。采用80 V 恒压电泳20 min，后加大电压至130 V 恒压电泳，使得蛋白移动至SDS-PAGE胶底部。取合适大小的PVDF膜甲醇激活，260 mA恒流转膜120 min，随后在5% BSA 封闭1 h，4 ℃冰箱孵育Ⅰ抗（1∶1 000）过夜。第 2 天取出对应 PVDF 膜，使用 TBST 洗涤 3 次，每次10 min。再加入Ⅱ抗（1∶5 000）室温孵育90 min，用TBST 重复以上步骤洗涤3 次，进行曝光并对目标蛋白进行灰度分析定量。

2.8 裸鼠皮下成瘤实验 取4 周龄的雌性裸鼠，于裸鼠背部接种5×106个143B 骨肉瘤细胞株。一周后，将小鼠随机分成两组，药物组8 只以麦冬皂苷B（50 mg/kg）灌胃，对照组8 只以等体积生理盐水灌胃，共21 d。1 月后，裸鼠实施安乐死，取下肿瘤，测量并计算肿瘤的重量与体积（肿瘤体积=肿瘤短径2×肿瘤长径×1/2）。同时取下裸鼠心、肝、脾、肺与肾组织，4%多聚甲醛固定后，切片，行HE 染色，同时肿瘤组织行免疫组化实验，显微镜下拍照。

3 统计学处理

数据采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示。CCK-8 实验、集落形成实验、细胞迁移实验、流式细胞术凋亡检测、蛋白灰度分析等单变量不同浓度间的比较采用单因素方差分析及Bonferroni 检验；其他处理组与对照组之间的两两比较采用成组设计资料t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 麦冬皂苷B对143B细胞活力和增殖能力的影响

CCK-8实验显示麦冬皂苷B 对骨肉瘤143B 细胞的活力有显著抑制作用，呈现剂量依赖性，48 h 的IC50为（19.17±2.71）μmol/L，与对照组相比，各处理组差异有统计学显著性（F=132.4，P＜0.05），见图1A；而麦冬皂苷B 对正常皮肤成纤维细胞毒性较低，仅在高浓度（40 μmol/L）时有轻微生长抑制作用，见图1B。

Figure 1.The inhibitory effect of ophiopogonin B on 143B cells.A：the results of CCK-8 assay showed the inhibitory effect of ophiopogonin B on the viability of 143B cells at 48 h；B：CCK-8 assay showed little inhibitory effect of ophiopogonin B on the viability of human primary skin fibroblasts（FB）at 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.图1 麦冬皂苷B对143B细胞活力的抑制作用

此外，集落形成实验结果显示，麦冬皂苷B 能显著抑制骨肉瘤143B 细胞的增殖能力，与对照组相比，各处理组差异有统计学意义（F=69.9，P＜0.05），见图2。

Figure 2.The effect of ophiopogonin B on colony formation ability of 143B cells.The cells were treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.图2 麦冬皂苷B抑制143B细胞的集落形成能力

2 麦冬皂苷B能促进143B细胞凋亡

流式细胞术实验结果显示，麦冬皂苷B 能够促进143B 细胞凋亡，随着药物浓度增加，凋亡细胞比例逐渐上升，与对照组相比，各处理组差异有统计学意义（F=94.49，P＜0.05），见图3A。Hoechst 33258染色显示，在荧光显微镜下，药物处理后部分细胞的细胞核呈现致密浓染的高亮蓝色荧光，且随着药物浓度的增加，高亮浓染细胞核的比例逐渐上升，与对照组相比，差异有统计学意义（F=69.96，P＜0.05），见图3B。Westernblot 结果显示，随着药物浓度的上升，cleaved caspase-3 和Bax 的蛋白水平逐渐上升，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 的水平逐渐下降，蛋白灰度分析结果显示，与对照组相比，各处理组差异有统计学意义（P＜0.05），见图3C。

Figure 3.Ophiopogonin B induced apoptosis of 143B cells.A：annexin V-FITC/PI staining and flow cytometric analysis of the apoptosis of 143B cells treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h；B：Hoechst 33258 staining for evaluating the morphological changes of apoptotic cells；C：Western blot for determining the protein levels of cleaved-caspase-3，Bcl-2 and Bax.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.图3 麦冬皂苷B诱导143B细胞凋亡发生

3 麦冬皂苷B对143B细胞迁移的抑制作用

Transwell 细胞迁移实验结果显示，麦冬皂苷B能够抑制骨肉瘤143B 细胞的迁移，且抑制作用随浓度的增加而加强，与对照组相比，各处理组差异有统计学意义（F=81.45，P＜0.05），见图4。

Figure 4.Ophiopogonin B inhibited 143B cell migration.The cells were treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.图4 麦冬皂苷B抑制143B细胞迁移

4 麦冬皂苷B可激活p38通路

Western blot 实验结果显示，麦冬皂苷B 可以激活p38 信号通路，p38 蛋白磷酸化程度随着药物的作用加强而上调，与对照相比，各药物处理组p-p38/p38蛋白水平的差异有统计学意义（F=58.18，P＜0.05）；而麦冬皂苷B 对JNK 信号通路与ERK 信号通路无显著激活作用，见图5。

Figure 5.Ophiopogonin B induced the activation of p38 signaling.Western blot was used to determine the protein levels of p-p38，p38，p-JNK，JNK，p-ERK and ERK in the 143B cells treated with ophiopogonin B at 0，10 and 30 μmol/L for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.图5 麦冬皂苷B激活p38信号通路

5 麦冬皂苷B通过p38信号通路促进细胞凋亡

为了进一步研究p38 通路在麦冬皂苷B 诱导的细胞凋亡中所发挥的作用，我们将p38 通路抑制剂SB203580与麦冬皂苷B共处理48 h。

CCK-8 实验显示，与药物单独处理组相比，共处理组在药物低浓度时细胞活力无显著差异，药物中、高浓度时细胞活力显著上升（48 h 药物浓度为20 μmol/L 时，F=2.392，P＜0.05；48 h 药物浓度为 30 μmol/L 时，F=2.333，P＜0.05；48 h 药物浓度为 40 μmol/L时，F=6.404，P＜0.05），见图6。

Figure 6.p38 inhibitor SB203580 reversed the drug-induced viability suppression in 143B cells treated with ophiopogonin B for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ophiopogonin B group.图6 p38抑制剂SB203580可缓解麦冬皂苷B对143B细胞活力的抑制作用

Western blot 实验结果显示，与单药物处理组相比，SB203580 与麦冬皂苷B 共处理组的p-p38/p38、cleaved caspase-3、Bcl-2 和 Bax 蛋白水平变化幅度显著减少（p-p38/p38，F=6.482，P＜0.05；cleaved caspase-3，F=2.61，P＜0.05；Bcl-2，F=5.84，P＜0.05；Bax，F=1.187，P＜0.05），见图7。因此，麦冬皂苷B可通过激活人骨肉瘤143B 细胞的p38 信号通路，进而促进凋亡的发生。

Figure 7.SB203580 reversed ophiopogonin B-induced 143B cell apoptosis.The cells were treated with ophiopogonin B at 30 μmol/L after pre-incubation of p38 inhibitor SB203580 at 10 μmol/L for 2 h.Western blot was used to determine the protein levels of p-p38，p38 cleaved caspase-3，Bcl-2 and Bax.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ophiopogonin B group.图7 SB203580能缓解麦冬皂苷B介导的143B细胞凋亡

6 麦冬皂苷B能抑制裸鼠皮下成瘤

裸鼠皮下成瘤结果显示，麦冬皂苷B 能抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。麦冬皂苷B 灌胃21 d 后，药物处理组肿瘤重量（0.525±0.235）g，对照组肿瘤重量为（0.983±0.307）g，与对照组相比，药物处理组差异有显著统计学意义（F=1.71，P＜0.05）；药物组肿瘤体积为（672.5±219.4）mm3，对照组肿瘤体积为（1207±362.9）mm3，与对照组相比，药物处理组差异有统计学意义（F=2.736，P＜0.05），见图8A。免疫组化结果显示，与对照组相比，药物处理组肿瘤组织中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3 的蛋白水平显著上升，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 蛋白水平显著下降，同时肿瘤组织中磷酸化p38 蛋白被显著激活，与体外细胞实验结果一致，见图8B。此外，药物处理后裸鼠的心、肝、脾、肺与肾组织并未发生损害，提示药物在治疗剂量内有较好的安全性，见图8C。

Figure 8.Ophiopogonin B inhibited osteosarcoma xenograft growth in vivo.A：image of the xenograft tumors dissected from nude mice（n=8 in each group）was shown，and the ultimate weight and volume of the tumors were evaluated；B：HE staining and immunohistochemical staining（cleaved caspase-3，Bcl-2 and p-p38）of the tumors；C：HE staining of heart，liver，spleen，lung and kidney of the mice.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group.图8 麦冬皂苷B能抑制裸鼠皮下成瘤

讨 论

骨肉瘤目前指南推荐的标准治疗方案是术前（新辅助）化疗、术中切除病灶和术后（辅助）化疗，其中化疗药物主要包括甲氨蝶呤，异环磷酰胺，阿霉素和顺铂等［6-7］。尽管化疗药物对骨肉瘤在一定程度上起到了抑制作用，然而其对于细胞的非选择性与高毒性给患者带来了严重的不良反应，譬如恶心呕吐，脱发、头晕和感染风险加剧等［8］。本研究表明，麦冬皂苷B在体外与体内能有效抑制骨肉瘤143B细胞的增殖与迁移，通过激活p38 信号通路，促进凋亡发生，从而起到抗肿瘤作用。

麦冬类植物的主要成分为皂苷类化合物，以螺旋甾烷为主要结构，含有A、B、B'、C、C'、D 和D'七种甾体皂苷，而麦冬皂苷B 是从麦冬中提取的重要单体。Gao 等［9］此前报道麦冬皂苷 B 能够通过 JNK/c-Jun 信号通路抑制结肠癌的进展。周志红等［4］研究发现麦冬皂苷B 在体外能够促进肝癌细胞HepG2 自噬的发生，从而抑制肝癌细胞的增殖。此外，吴德芹等［10］报道在小鼠肺癌体内模型中，麦冬皂苷B 能够抑制非小细胞肺癌体内的迁移。但有关麦冬皂苷B在人骨肉瘤细胞发生、进展及凋亡中的作用机制研究尚未见文献报道。

凋亡是一种以有序清除损伤细胞为目的的程序性死亡过程，形态学上以细胞皱缩和染色质浓聚为最显著特征［11］。凋亡不仅可被细胞内信号激发，如基因毒性应激反应；也可以被细胞外信号激发，如细胞表面死亡受体的激活［12］。在肿瘤的发生与进展过程中，凋亡相关的信号失调是一个重要表现。因此，靶向调控凋亡相关信号通路的药物成为了肿瘤治疗的重中之重。我们通过流式细胞术和Hoechst 33258染色发现，在麦冬皂苷B 作用下的骨肉瘤细胞增殖显著减弱，细胞存活率明显下降，且出现染色质浓聚、细胞皱缩、核碎裂等形态学表现。药物作用下，裸鼠肿瘤组织的凋亡水平同样上升，肿瘤生长减慢，与体外细胞结果一致。为进一步从分子水平探究凋亡的发生，我们检测了典型的凋亡相关蛋白，结果显示，麦冬皂苷B可促使凋亡相关蛋白cleaved caspase-3 和Bax 显著上升，凋亡抑制因子Bcl-2 显著下调，且呈现一定浓度相关性，这与流式细胞术的结果相佐证。此外，我们发现在治疗剂量内，麦冬皂苷B 对正常细胞的毒性较低。在体外裸鼠成瘤模型中，麦冬皂苷B 有效的抑制了肿瘤的生长，促进了肿瘤的凋亡，且对各个主要器官均未造成明显的毒副作用，体现了其良好的安全性。

目前研究已经发现多条与凋亡相关的信号通路，如p38 MAPK 信号通路、IL-6/STAT3通路等。p38信号通路作为经典的MAPK 信号通路之一，与生物体内多种病理生理过程密切相关。当体内的p38 蛋白异常活化及磷酸化后，能与多种细胞因子、蛋白以及基因相互作用，激活凋亡信号IL-6/STAT3 通路。此前，有文章报道p38 MAPK在顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡中发挥了重要作用［13］。也有相关研究指出积雪草苷可以通过抑制NF-κB 与p38 通路减轻小鼠低氧性肺动脉高压［14］。本课题研究发现麦冬皂苷B 能特异性激活p38信号通路，但不影响JNK 和ERK通路。在此基础上，我们添加了一种特异性的p38通路的抑制剂SB203580 与麦冬皂苷B 共处理48 h，发现中高浓度即能显著逆转麦冬皂苷B 对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用，随作用时间的延长效果越明显。

综上所述，本课题通过细胞分子生物学检测手段，探究了麦冬皂苷B 对骨肉瘤143B 细胞的抑制作用及相关分子机制。本研究发现，一定量的麦冬皂苷B 能通过p38 MAPK 通路显著抑制人骨肉瘤143B细胞的增殖，并诱导细胞发生凋亡，且抑制作用与药物剂量和作用时间呈正相关。该实验结果为麦冬皂苷B 未来是否可用于临床骨肉瘤治疗提供了实验与理论基础。