基于Nrf2/HO-1信号通路研究迷迭香酸对抑郁模型大鼠的保护作用*

赖根祥， 朱桂东， 何慧明

（1丽水市第二人民医院精神科，2丽水学院医学与健康学院科研办，浙江丽水323000）

抑郁症作为一种严重的情感障碍性精神疾病，其发病率逐年增加，并逐渐成为全球性公共卫生问题，给人们带来了沉重的健康和经济负担［1］，因此寻找有效的抗抑郁药迫在眉睫。过往认为，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）失调和神经递质改变等为抑郁症的发病基础，近年来脑内炎症和氧化应激被认为与抑郁症密切相关［2］。研究显示，环境中的慢性压力可引发机体的炎症反应，导致大脑神经细胞损伤，而脑损伤的过程也涉及高氧化应激反应［3-4］。通过提高抗氧化酶活性，可降低机体活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，减轻其诱导的氧化损伤，并可抑制炎症通路活化，保护神经元结构的完整性，从而减轻抑郁症状［5-6］。核因子E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血 红 素 加 氧 酶 1（heme oxygenase-1，HO-1）信号通路为机体主要的抗氧化信号通路之一，在氧化应激条件下，Nrf2 从与Keap1 结合的聚合物中释放出来并转移到细胞核中，与HO-1等基因的启动子序列结合，引起其转录和蛋白水平变化，进而激活细胞的抗氧化保护程序［7］。研究表明，Nrf2/HO-1 信号通路蛋白含量下调及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，引起机体ROS 水平增高，在氧化应激和炎症损伤中发挥重要作用，与抑郁症密切相关，可能是其治疗靶标［8］。由于目前抗抑郁药仅可减轻或消除病理性抑郁情绪，不能影响其病理过程，且存在不同程度的副作用，因此，抑郁症发病机制中的关键通路可能成为新型抗抑郁药物的作用靶点。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）存在于薄荷和紫苏等唇形科药用植物中，具有抗氧化、消炎和抗凋亡等作用［9］。研究显示，RA 可上调 Nrf2 和 HO-1 的表达，减轻氧化应激并抑制体内神经元死亡，具有神经保护作用［10］。另有研究指出［11］，RA 可通过促进海马组织中ERK1/2的磷酸化，诱导其释放BDNF，发挥抗抑郁作用。然而中药可通过作用于多靶点在多维度发挥治疗作用，RA 对抑郁症的治疗作用是否涉及Nrf2/HO-1 信号通路并不清楚。本研究采用孤养结合慢性不可预知性轻度刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）法复制抑郁症大鼠模型，并基于Nrf2/HO-1 信号通路进一步分析RA 对抑郁症的治疗机制。

材料和方法

1 动物

60 只 SPF 级 6 周龄雄性 SD 大鼠，体重 180～200 g，由河南省实验动物中心提供，许可证号为SCXK（豫）2017-0001。统一适应性饲养1周后进行实验。

2 主要试剂及仪器

RA（纯度≥98%；Sigma）；Nrf2 抑制剂 Nrf2-IN-1（MCE）；兔抗 HO-1、Nrf2 和 β-actin 单克隆抗体（CST）；兔抗NAD（P）H：醌氧化还原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］、核纤层蛋白B（lamin B）和离子钙结合衔接分子1（ionized calciumbinding adapter molecule 1，Iba1）单克隆抗体、兔抗BDNF 多克隆抗体、Alexa Fluor®488 标记的 IgG 及DAPI 试剂（Abcam）；ROS 和丙二醛（malonydialdehyde，MDA）检测试剂盒（碧云天）；HE 染色试剂盒、SOD 检测试剂盒及大鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）ELISA 试剂盒（上海生工）。酶标仪和转膜系统（Bio-Rad）；多功能酶标仪（BioTek）。

3 实验方法

3.1 抑郁症模型的制备及分组 将大鼠随机分为：对照（control，Cont）组、CUMS 组、CUMS+RA 组和CUMS+RA+Nrf2-IN-1 组，每组 15 只。除 Cont 组，均采用孤养结合CUMS 法复制大鼠抑郁症模型［12］。3周后，大鼠活动减少、皮毛暗淡发黄、糖水偏好指数降低，表明抑郁症模型造模成功。于第4～6 周每天固定时间，依次给予上述各组大鼠生理盐水、生理盐水、10 mg/kg RA［11］和10 mg/kg RA+1 mg/kg Nrf2-IN-1灌胃治疗1 次，连续3 周，给药期间继续进行CUMS刺激［12］。

3.2 糖水偏好实验 末次给药24 h 后，在安静环境中进行该项实验。将大鼠单独置于笼中，实验前2 d，放入加有1%蔗糖水溶液（200 mL）的2 个平口杯，以让大鼠适应糖水；第3 天禁水禁食24 h，第4 天放入分别加有纯水（200 mL）和1%蔗糖水溶液（200 mL）的2 个平口杯，并称取两杯质量，之后让大鼠自由饮水，12 h 后更换两杯位置，24 h 后再次称取两杯质量。糖水偏好指数（%）=［蔗糖水消耗量（/蔗糖水消耗量+纯水消耗量）］×100%。

3.3 强迫游泳和悬尾实验 强迫游泳和悬尾实验参考文献［13-14］进行，分别记录大鼠被迫游泳和悬尾后4 min 内的静止时间。游泳静止标准：四肢完全不动身体浮出水面、仅头部浮于水面或四肢间歇性微幅划动以保持漂浮状态。悬尾静止标准：四肢完全不动或间歇性微幅摆动。

3.4 样本采集 方法3.3 完成后，每组取5 只大鼠，麻醉后用磷酸盐缓冲液和4%多聚甲醛溶液灌注，取出大脑在4 ℃条件下浸入4%多聚甲醛固定24 h，转移到20%蔗糖溶液中，-80 ℃储存，进行HE 染色和免疫荧光分析。剩余大鼠麻醉处死后，快速取出海马组织，存储在-80 ℃，进行Western blot 和相应检测。

3.5 HE 染色和免疫荧光实验 将方法3.4 中冷冻的脑组织切片（10 μm），依次与苏木素染液和伊红染液孵育后，使用显微镜观察海马组织中受损的细胞。另外，将冷冻切片依次与Ⅰ抗［Iba1（1∶200）］、Alexa Fluor®488 标记的Ⅱ抗（1∶500）和DAPI 避光孵育后，使用荧光显微镜观察小胶质细胞活化情况。

3.6 Western blot 实验 取方法3.4 冻存的部分海马组织，裂解后提取总蛋白并采用试剂盒分别提取胞浆蛋白和核蛋白，均用BCA 法测定蛋白浓度。取30 μg 上述蛋白煮沸后上样，电泳分离后转至PVDF膜并封闭，加入Ⅰ抗［HO-1（1∶1 000）、NQO1（1∶250）、BDNF（1∶500）、Nrf2（1∶500）、β-actin（1∶1 000）和lamin B（1∶500）］，4 ℃过夜孵育，洗膜，加入Ⅱ抗（1∶1 000）孵育1 h，显影后使用Tanon 凝胶成像系统曝光拍照并进行灰度分析。

3.7 试剂盒检测 取方法3.4 中冻存的海马组织，称重后制备匀浆液，取上清按照说明分别加入ROS、MDA、SOD、IL-6、IL-1β 和TNF-α 试剂盒中的相应试剂。ROS 水平使用荧光酶标仪检测荧光强度表示；MDA 浓度使用酶标仪在波长530 nm 处检测吸光度；SOD 活性使用酶标仪在波长560 nm 处检测吸光度；IL-6、IL-1β 和 TNF-α 使用酶标仪检测波长 450 nm 处吸光度。对照标准曲线计算上述指标水平。

4 统计学处理

采用SPSS 25.0进行统计分析。采用均数±标准差（mean±SD）表示计量数据。采用单因素方差分析行多组间比较，SNK-q检验进一步两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 RA对CUMS大鼠抑郁样行为的影响

与Cont 组相比，CUMS 组大鼠强迫游泳和悬尾静止时间延长（P＜0.05），糖水偏好指数降低（P＜0.05）；与 CUMS 组相比，CUMS+RA 组大鼠强迫游泳和悬尾静止时间缩短（P＜0.05），糖水偏好指数增高（P＜0.05）；与 CUMS+RA 组相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 组强迫游泳和悬尾静止时间延长（P＜0.05），糖水偏好指数降低（P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠抑郁样行为的比较Table 1.Comparison of depression-like behaviors in the 4 groups（Mean±SD. n=15）

2 RA对CUMS大鼠海马神经元的影响

HE 染色结果显示，Cont 组海马区神经元排列致密，细胞边界清楚，染色均匀；而CUMS 组海马神经元排列疏松紊乱，边界模糊，胞核皱缩染色较深；给予RA 治疗后，上述细胞损伤明显改善，而Nrf2 抑制剂可逆转这种改善作用。见图1。

Figure 1.Morphological changes of hippocampal neurons in the 4 groups（HE staining）.The arrows showed degenerative neurons.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.图1 4组大鼠海马神经元的形态改变

3 RA对CUMS大鼠小胶质细胞浸润的影响

Cont组Iba1+小胶质细胞数量较少，体积较小；而CUMS 组Iba1+小胶质细胞数量和突起较多，体积较大；与 CUMS 组相比，CUMS+RA 组 Iba1+小胶质细胞数量和突起减少，体积变小；与CUMS+RA 组相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1组Iba1+小胶质细胞数量和突起增多，体积增大。见图2。

Figure 2.Infiltration of microglia in the 4 groups（Iba1 immunofluorescence staining）.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.图2 4组大鼠小胶质细胞浸润情况

4 RA 对 CUMS 大鼠海马组织中 IL-6、IL-1β 和TNF-α水平的影响

与 Cont 组相比，CUMS 组海马组织中 IL-6、IL-1β和 TNF-α 水平上升（P＜0.05）；与 CUMS 组相比，CUMS+RA 组 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水 平下 降（P＜0.05）；与CUMS+RA组相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1组IL-6、IL-1β和TNF-α水平增高（P＜0.05）。见表2。

表2 4组大鼠海马组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比较Table 2.Comparison of IL-6，IL-1β and TNF-α levels in the 4 groups（ng/L.Mean±SD. n=10）

5 RA对CUMS大鼠海马组织中氧化应激的影响

与 Cont 组相比，CUMS 组 ROS 和 MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）；与 CUMS 组相比，CUMS+RA 组 ROS 和 MDA 水平下降（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）；与 CUMS+RA 组相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 组 ROS 和 MDA 水平升高（P＜0.05），SOD活性下降（P＜0.05）。见表3。

表3 4组大鼠ROS、MDA和SOD水平的比较Table 3.Comparison of ROS，MDA and SOD levels in the 4 groups（Mean±SD. n=10）

6 RA对CUMS大鼠海马组织中Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白的影响

与Cont 组相比，CUMS 组海马组织中HO-1、NQO1、BDNF 及核/质 Nrf2 蛋白表达降低（P＜0.05）；与 CUMS 组相比，CUMS+RA 组 HO-1、NQO1、BDNF及核/质Nrf2 蛋白表达增高（P＜0.05）；与CUMS+RA组相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 组HO-1、NQO1、BDNF及核/质Nrf2蛋白表达降低（P＜0.05），见图3、表4。

Figure 3.The expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in the 4 groups.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.图3 4 组大鼠海马组织中Nrf2/HO-1 信号通路相关蛋白的表达情况

表4 4组大鼠海马组织中Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达的比较Table 4.The expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in the 4 groups（Mean±SD. n=10）

讨 论

抑郁症为危害全球人类身心健康的常见精神疾病之一，临床实践中通常采用氟西汀等抗抑郁药来治疗抑郁症，但只可减轻部分患者的抑郁情绪［15］，而不能从发病机制上实现治愈。大鼠等啮齿类动物和人类之间的社交行为相似，因此常用来制备抑郁症模型［16］。采用CUMS 法诱导的大鼠抑郁症模型最明显的特征是快感减退，这也是抑郁症患者的基本症状，因此该模型可用于选择理想的抗抑郁药物及抑郁症病理机制的进一步研究［17］。

CUMS 暴露导致的抑郁症伴随有小胶质细胞病变等神经损伤，正常情况下，小胶质细胞在中枢神经系统中以静息状态存在，当出现炎症和创伤等异常刺激时被活化为具有巨噬细胞功能的状态，介导神经炎症和神经变性［18］，并分泌 IL-6、IL-1β 和 TNF-α等，在神经炎症损伤中起重要作用。因此，抑制小胶质细胞介导的炎症可能是减少抑郁样行为的有效策略。本研究中，我们在CUMS 诱导的抑郁症大鼠海马组织中观察到神经元损伤和小胶质细胞浸润程度均显著加重，且 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平增高，证实了小胶质细胞介导的海马神经炎症损伤参与抑郁症的病理过程，一方面，活化后的小胶质细胞向损伤部位迁移，并分泌TNF-α 和ROS等因子，这些因子具有细胞毒性，会损伤或杀死神经细胞，引起神经系统的炎症［19］；另一方面，上述因子可进一步加剧小胶质细胞活化，加速神经系统病变进展，引起或加重神经损伤［20］。

脑部氧化应激和炎症是相互影响的两种病理过程，在抑郁症［21］等多种神经系统疾病中共同发挥致病作用，Nrf2/HO-1 信号通路在其中发挥重要作用。当脑部处于应激状态时，过量ROS 等刺激可使Nrf2与其阻遏蛋白Keap1 解离并诱导Nrf2 转移至细胞核，与抗氧化反应元件结合，调节HO-1等抗氧化基因或BDNF 等表达，提高抗氧化和神经保护能力［22］。本研究检测显示，CUMS 组大鼠海马组织中HO-1 和NQO1 及核/质 Nrf2 蛋白表达较 Cont 组降低，表明海马组织中Nrf2/HO-1 信号通路参与CUMS 大鼠抑郁症的病理进程。推测其机制可能为：（1）在CUMS 组大鼠中Nrf2/HO-1通路活化受抑，HO-1和NQO1等的表达较低，导致机体抗氧化能力较低，引起ROS 和MDA等水平升高，机体处于高氧化应激状态，损伤神经系统［23］；（2）Nrf2/HO-1通路活化受抑引起BDNF等神经保护因子水平降低，导致其对小胶质细胞炎症和ROS 等氧化损伤的保护作用不足，从而加重抑郁症的病理过程中神经炎症和脑氧化损伤［24］。

RA 具有抗氧化、抗焦虑和抗抑郁等药理活性，可通过减少活性氧反应性物质的产生，降低脂多糖诱导的星形胶质细胞坏死［25］，还可减轻脂多糖诱导的神经炎症和氧化应激，改善小鼠记忆力和行为障碍［26］。本研究检测到，给予 RA 治疗后，CUMS 大鼠快感增加，抑郁样行为和小胶质细胞炎症减轻，IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS 和 MDA 水平降低，HO-1、NQO1、BDNF 和核/质 Nrf2 蛋白表达及 SOD 水平均升高，表明RA 可活化Nrf2/HO-1 信号通路，减轻小胶质细胞炎症反应和氧化应激，改善CUMS 所致抑郁样行为。分析其作用机制可能为：（1）RA 可促进 Nrf2/HO-1 信号通路活化来上调HO-1 和NQO1 等表达，增强清除ROS 的能力，减轻其造成的氧化损伤并阻断其对炎症反应的激活，减少对神经的损伤［27］；（2）RA 可减少小胶质细胞炎症和炎症因子产生，从而减轻神经炎症［28］；（3）RA 可增加BDNF 等表达，从而提高机体的神经保护能力［29］。同时，本研究结果还显示，RA 对CUMS 大鼠抑郁样行为的改善作用及对氧化应激和小胶质细胞炎症的抑制作用可被Nrf2 抑制剂阻断，进一步佐证上述推测。

综上所述，RA 可通过活化海马组织中Nrf2/HO-1 信号通路，降低ROS 水平，抑制其造成的氧化应激和炎症损伤，减轻CUMS 大鼠抑郁症状，进一步丰富了RA 的药理机制。然而抑郁症涉及机制复杂，且RA 可能作用于多通路进而减轻抑郁症状，其作用机制有待继续完善。