菜心EMS诱变条件优化与突变体库构建

张艳 洪晓如 黎庭耀 沈卓 杨易 周轩 陈汉才

摘要：【目的】明确甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理菜心种子的最佳浓度和处理时间，为EMS诱变技术在菜心种质资源创新利用方面及丰富菜心种质资源选育提供支持。【方法】设4种不同浓度的EMS溶液（0.2%，0.4%，0.6%和0.8%）和3种不同处理时间（8、12和16 h）共12个组合，诱变处理2个菜心自交系（C40和小80天）的种子，并对诱变后代出苗率和结籽株比例进行分析，筛选EMS诱变菜心种子的最佳处理条件。【结果】随着EMS浓度的增加，菜心种子成苗率和结籽株比例逐渐降低。诱变处理8 h，EMS浓度为0.6%时，C40和小80天菜心的成苗率分别65%和70%，结籽株比例分别为13%和31%;EMS浓度升高至0.8%时，C40菜心的成苗率降至50%，2个菜心材料的结籽株比例均低于20%。随着EMS处理时间的延长，菜心种子成苗率和结籽株比例逐渐降低。EMS处理浓度为0.4%时，诱变12 h，2个菜心材料（C40和小80天）的成苗率均为75%，结籽株比例分别为30%和45%;诱变16 h，C40和小80天菜心的成苗率分别降至60%和55%，结籽株比例均低于20%。EMS诱变处理不仅抑制成苗率，还严重影响结实情况。根据成苗率和M1群体植株的结籽株比例，并保证最大诱变效率和突变体群体，确定菜心种子EMS诱变处理的最佳条件为0.4% EMS诱变处理12 h。不同基因型菜心材料对EMS的耐受性不同，生长势强的菜心材料EMS处理的时间或浓度可适当增大或降低。采用最佳诱变条件处理3000粒小80天菜心种子，在M1群体中出现黄化、白化、皱缩、矮化及嵌合等变异性状，M1群体包含500个突变株系。随机选取种子量大的M1群体中176个家系，构建包含2110个单株的M2群体，在M2群体中发现94个突变单株，总的突变频率为4.3%。其中，叶片叶色或形状突变的单株61株，株型变异的单株共31株，花色突变的单株2株。【结论】利用EMS诱变菜心种子有明显效果，构建的菜心EMS突变体库表型变异丰富，尤其是出现株型紧凑，叶色浓绿的有益突变，可用于菜心功能基因组学研究和育种。

關键词： 菜心;EMS诱变;突变体库;表型变异

中图分类号： S634.5                                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1022-08

Optimization of EMS mutagenesis condition and construction of mutant library in flowering Chinese cabbage

ZHANG Yan， HONG Xiao-ru， LI Ting-yao， SHEN Zhuo， YANG Yi，

ZHOU Xuan， CHEN Han-cai*

（Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou  510640， China）

Abstract：【Objective】This research aimed to clarify the optimal concentration and time of ethylmethylsulfone（EMS） mutation treatment of flowering Chinese cabbage， it provided support for the innovation and utilization of EMS mutagenic technology in flowering Chinese cabbage germplasm resources and enriching the selection of flowering Chinese cabbage germplasm resources. 【Method】Two high-generation inbred lines C40 and Xiao 80 Days were mutated by EMS solution of different concentrations（0.2%， 0.4%， 0.6% and 0.8%） under different treatment times（8， 12 and 16 h）. The adult plant rate and rate of seed-setting plant after mutation were investigated to determine the best mutagenesis conditions. 【Result】Under the same EMS treatment time， the adult plant rate and seed-setting plant rate of flowering Chinese cabbage decreased gradually with the increase of EMS concentration. When the EMS concentration was 0.6%， the adult plant rate of C40 and Xiao 80 Days were 65% and 70%， respectively; and the seed-setting plant rate of two materials were 13% and 31% respectively. When EMS concentration was 0.8%， the adult plant rate of C40 decreased to 50%， and the seed-setting plant rate of both materials was less than 20%. Under the same concentration of EMS， the longer the mutagenesis time was， the worse the adult plant rate and seed-setting plant rate. When EMS concentration was 0.4%， mutagenesis time was 12 h， the adult plant rates of C40 and Xiao 80 Days were both 75%， and the the seed-setting plant rate of two materials were 30% and 45% respectively. After 16 h， the adult plant rates were reduced to 60% and 55%， and the seed-setting plant rates were reduced， both below 20%. EMS treatment not only inhibited the adult plant rate， but also seriously affected the seed-setting plant rate. According to the adult plant rate and the seed-setting plant rate of M1 population， and to ensure the maximum mutation efficiency and mutant population， the optimal EMS mutatgenic condition was determined as 0.4% EMS mutation treatment for 12 h. The tolerance of different genotypes of flowering Chinese cabbage to EMS was different， and the treatment time or concentration of EMS could be appropriately increased or decreased on plants grew well. 3000 seeds of Xiao 80 Days were treated with the best mutagenic conditions， and 500 M1 mutant lines were obtained. In M1 population， there were some variation characters such as yellowing， albinism， shrinkage， dwarfing and chimerism. 176 M1 families with large seed quantity were randomly selected to construct M2 population with 2110 individuals. 94 mutant individuals were found in M2 population， and the total mutation frequency was 4.3%. There were 61 plants with leaf color or shape mutation， 31 plants with plant type mutation and 2 plants with flower color mutation. 【Conclusion】EMS mutagenesis of flowering Chinese cabbage seed has obvious effect. The EMS mutant library is rich in phenotypic variation， especially the beneficial mutation of compact plant type and dark green leaf color， which can be used in the functional genomics research and breeding of flowering Chinese cabbage.

Key words： flowering Chinese cabbage; EMS mutagenesis; mutant library; phenotypic mutation

Foundation item： Key Area Research and Development Project of Guangdong（2018B020202010）;Science and Technology Project of Guangdong（2018A050506051）; Science and Technology Project of Guangzhou（202002020007）

0 引言

【研究意义】菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）为十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种，是广东省栽培面积最大的蔬菜品种。因其独特的风味和优异的品质，2006年以来菜心在北方地区及长江流域栽培面积逐年增加（张华和刘自珠，2010;李光光等，2011;张艳等，2016）。但是在育种研究方面，由于片面追求高产优质，菜心种质资源的遗传多样性逐渐丧失，使得菜心抵抗环境胁迫的能力变得十分脆弱，给其产业发展带来极大风险（张艳等，2016）。利用诱变技术创造有利变异是解决当前菜心育种遗传资源狭窄、种质资源匮乏的有效途径之一。【前人研究进展】甲基磺酸乙酯（EMS）是一种广泛使用的化学诱变剂，具有效率高、负作用小、易操作等优点，且产生的突变以点突变为主，易于遗传分析，目前已被广泛应用于植物的相关遗传研究和诱变育种工作中（Greene et al.，2003;谷福林等，2004）。在玉米中，王环环等（2014）通过EMS诱变筛选出1个花器官异常发育的突变体apl，并将其定位在1号染色体上;谭义川（2015）通过EMS诱变筛选出4份抗旱性较好的突变株系;周文期等（2020）利用EMS诱变玉米自交系K22花粉，分离到调控玉米叶形态建成相关突变体sep-1和dsp-1，并对调控表皮形态建成的候选基因进行图位克隆。在水稻中，Lee和Lee（2002）利用EMS处理水稻花药愈伤组织，从A2代双单倍体中筛选出14个稳定突变体、4个半矮化突变体、2个颗粒型突变体和8个无毛突变体;陈忠明和王秀娥（2005）通过EMS诱变恢复系9311种子筛选获得大粒突变体M316，M316整精米的粒长由原来的6.9 mm增加到8.0 mm，千粒重由原来的31.0 g提高到35.6 g;叶俊等（2006）利用EMS溶液处理籼稻9311种子，获得210份叶、茎、穗和根等性状变异的突变体;倪浩凌等（2020）利用水稻EMS诱变突变体库，通过田间筛选，得到9个穗发芽突变体，对其中的2个突变体进行突变基因定位克隆，分别获得穗发芽候选基因LOC_Os03g08570和LOC_Os07g10490。在芸薹属作物中，利用EMS诱变构建突变体库主要集中在甘蓝型油菜、白菜型油菜及大白菜上。通过EMS诱变不同油菜品种，前人创建了多个油菜突变体库（Wang et al.，2008;石从广等，2010;曲高平，2014;杨建胜等，2018），这些突变体库包括形态变异、品质变异及生理学特性变异等新种质。Guirgis等（2009）用EMS诱变印度芥菜型油菜来选择对重金属有抗性的突变体，从EMS突变后代筛选出4个对重金属有抗性的超富集植株。Zeng等（2011）用EMS诱变甘蓝型油菜自交系T6，并从突变后代中获得1个矮秆株突变体。Harloff等（2012）用EMS分别诱变油菜品种YNO-429和Express 617，获得2个突变体库，分别筛选出229和341个突变体。在大白菜中，卢银等（2015）、黄胜楠（2016）构建了表型丰富的大白菜突变体库，筛选出持绿、花瓣退化及雄性不育等多个突变体;Fu等（2020）通过EMS诱变，筛选到13份早抽薹突变体，对其中的2份突变体进行基因定位克隆，发现BrSDG8在调控大白菜抽薹开花上发挥重要作用。【本研究切入点】虽然EMS诱变技术已在多种作物的品种选育和遗传研究中得到广泛应用，但目前尚无EMS诱变菜心及突变体库构建的相关报道。【拟解决的关键问题】通过不同浓度EMS溶液在不同处理时间下诱变菜心高代自交系C40和小80天的种子，探讨适用于菜心种子EMS诱变的最佳条件，为EMS诱变技术在菜心种质资源创新中的利用提供技术支持;同时，经EMS诱变处理，构建菜心突变体库，筛选菜心突变体，为拓宽菜心遗传背景及菜心功能基因组研究和新品种选育提供材料基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

菜心高代自交系材料C40和小80天由广东省农业科学院蔬菜研究所提供。C40菜心早熟，圆叶，苔高约22.0 cm，横径1.5～2.0 cm，播种至初收28～32 d。小80天菜心晚熟，圓叶，苔高约25.0 cm，横径2.0～2.5 cm，播种至初收43～46 d。主要试剂：EMS为美国Sigma公司生产，以pH 7的磷酸缓冲液稀释配制;以5%硫代硫酸钠（Na2S2O3）作为终止解毒剂;其他化学试剂均为国产分析纯。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 EMS诱变最佳处理条件筛选 于2016年10月挑选饱满的菜心高代自交系材料C40和小80天种子，分别设4个处理浓度（0.2%、0.4%、0.6%和0.8%）和3个处理时间（8、12和16 h）。每处理100粒种子，保证药液完全淹没种子，对照（CK）为纯水处理。诱变处理后，先用5% Na2S2O3溶液冲洗种子，终止反应，再用流水冲洗种子2 h，然后播种于装有育苗基质的育苗盘中进行水浮式育苗，成苗后移栽至田间，按常规方法管理。统计并分析诱变后菜心种子的成苗率、长势和结籽株比例等，筛选菜心种子EMS诱变最佳处理条件。

成苗率（%）=（苗期成苗株数/处理种子数）×100

结籽株比例（%）=（结籽株数/处理种子数）×100

1. 2. 2 菜心突变体库的构建 于2017年10月挑选饱满的菜心高代自交系小80天种子3000粒，用0.4% EMS处理12 h，然后育苗移栽，获得M1群体，然后对M1群体的植株进行自交授粉收获M2群体种子。随机选取种子量大的176份M2群体种子，挑选15粒饱满种子作为M2群体家系，按照家系双行条播种植，构成M2群体。种植试验在广东省农业科学院白云试验基地进行，按常规方法管理。以野生型菜心小80天为对照，对突变体库M1、M2群体中单株的变异性状进行调查。主要调查性状为株型、薹色、叶色、叶形和花色等。

1. 3 统计分析

采用Excel 2000进行试验数据统计分析，使用SPSS 22.0分析出苗率和结籽株比例差异。

2 结果与分析

2. 1 最佳诱变条件的筛选

不同EMS处理浓度对菜心种子萌发及生长发育产生不同影响。0.2% EMS处理8 h后菜心种子的成苗率与CK相当，但比CK植株生长旺盛，早抽薹1～2 d，表明低浓度EMS短时间诱变对菜心种子的萌发和生长具有促进作用。随着EMS浓度的增大，菜心种子成苗率和结籽株比例逐渐降低。当诱变处理8 h，EMS浓度为0.6%时，C40和小80天菜心的成苗率分别为65%和70%，结籽株比例为13%和31%;EMS浓度升至0.8%时，C40菜心成苗率降至50%，小80天菜心成苗率变化不明显，结籽株比例均低于20%（图1和图2）。

由图1和图2还可看出，随着EMS处理时间的延长，菜心种子成苗率和结籽株比例逐渐降低。EMS处理浓度为0.4%时，诱变12 h，C40和小80天菜心的成苗率均为75%，结籽株比例分别为30%和45%;诱变16 h，C40和小80天菜心的成苗率分别降至60%和55%，结籽株比例均低于20%，表明EMS诱变不仅会抑制成苗率，还会严重影响结实情况。当EMS浓度为0.6%、处理时间为12 h时，M1群体出苗率接近半致死，但结籽株比例低于20%，不利于突变体库的构建。除了尽可能提高诱变频率外，还必须保证一定规模突变体库的构建，综合比较，最终选择0.4% EMS、诱变处理12 h为构建菜心突变体库的最佳处理条件。

不同基因型菜心材料对EMS的耐受性不同，C40菜心明显弱于小80天菜心。0.4% EMS处理种子16 h，C40菜心的成苗率为60%，基本不结籽，而小80天菜心的结籽株比例为16%;0.6% EMS处理种子12 h，C40菜心与小80天菜心的成苗率相同，但C40菜心生长势较小80天菜心弱，且结籽株比例仅5%，低于小80天菜心。不同菜心自交系材料对EMS的耐受性可能与植株的生长势有关系，与C40菜心相比，小80天菜心植株高大强壮，根系发达。因此，生长势强的菜心自交系EMS处理的时间或浓度可适当增大。

2. 2 菜心突变体库M1群体表型变异

用0.4% EMS处理3000粒小80天菜心种子12 h，2019株成苗。M1群体幼苗定植于大棚网室，开花期套袋自交，成熟期分单株收获种子。在M1群体中，50%以上植株不结实或结实性差，仅收获500个单株种子。经EMS处理的M1群体植株，长势较CK差异明显，主要表现为植株矮小，叶片黄化、白化（图3-A和图3-B），叶片皱缩、畸形（图3-E和图3-F），叶片为嵌合体（图3-C和图3-D），花色变化（图3-G），丛枝（图3-H）等变异性状。通过对M1群体中自交后代的表型鉴定，发现白化、黄化、嵌合、畸形等一些变异性状不能遗传，可能是EMS化学药剂伤害造成的性状变化。

2. 3 菜心突变体M2群体性状变异

随机选取M1群体中种子量大的176个单株，按家系双行条播种植，共获得176个家系的2110个成活的M2单株，构成M2群体。在M2群体中，全生育期内对其表型进行调查，发现表型变异株，包括叶形、叶色、株型、花色、生育期等五大类突变。

2. 3. 1 M2群体叶片性状突变分析 野生型小80天菜心叶色油绿、椭圆形（图4-A）。在M2突变群体中出现很多叶色和叶形的变异，如心叶黄化，随着生长发育，叶色逐渐转变为正常颜色或死亡（图4-B和图4-C）;叶脉周围叶片颜色加深或变浅，形成花叶（图4-D和图4-F）;叶色加深变为浓绿色（图4-G和图4-H）;部分叶片皱缩（图4-I）、卷曲（图4-J）;有些叶片由椭圆形变为柳叶形或圆形（图4-K和图4-L）。在M2突变群体中，叶片颜色或形状突变的单株共61株，变异频率为2.8%，且叶片突变在所有表型突变中占有较高比例，占总变异性状数的64.9%（表1）。叶片黄化或者畸形的植株大多数长势较差，在生长的过程中逐渐死亡或难以收获种子。

2. 3. 2 M2群体株型性状突变分析 小80天菜心野生型株型直立、单薹、薹色油绿（图5-A）。在M2突变群体中发现一些株型变异的植株，其中典型的变异类型为叶片夹角变小，株型直立紧凑（图5-B）;叶柄变厚变宽、肥大多汁（图5-C）;多薹、丛生在M2突变群体中侧芽增多（图5-D）;主薹颜色变浅、有蜡粉（图5-E）;叶片夹角变大，株型披散、开展度变大，侧芽增多（图5-F）;植株生长缓慢，不抽薹（图5-G和图5-H）。在M2突變群体中，株型变异的单株共31株，变异频率为1.5%（表1）。

2. 3. 3 M2群体花色性状突变分析 小80天菜心野生型花瓣为金黄色（图6-A），在M2群体中出现少量花色变异，其中2株花色由黄色变为白色，变异频率为0.09%（图6-B和图6-C）。

3 讨论

EMS是一种良好的化学诱变剂，已被广泛应用于作物诱变育种。EMS突变体库成功构建的关键是最佳诱变条件的确定。通过EMS诱变获得突变体，多以发芽率达半致死作为选择最佳诱变处理条件的标准。本研究以4个诱变浓度（0.2%、0.4%、0.6%和0.8%）和3个诱变时间（8、12和16 h）的组合，对2个菜心高代自交系（C40和小80天）进行诱变。结果发现，EMS处理除了抑制菜心种子成苗率外，还严重影响M1群体植株的结籽情况。这与卢银等（2015）的研究结论较一致，即用0.4% EMS诱变处理大白菜种子，诱变1次，M1群体植株的结籽植株比例为89.1%，诱变2次，M1群体植株的结籽植株比例将为75.5%。

不同菜心材料对EMS的耐受性不同，C40菜心明显弱于小80天菜心，可能与植株的长势有关系，生长势强的菜心材料EMS处理的时间或浓度可适当增大，与芸薹属其他作物的研究结果较一致。曲高平（2014）分别采用0.4%、0.8%和1.2%的EMS处理油菜种子，发现随EMS浓度的增大，变异率先增大后减少，1.0% EMS浸种12 h是最佳诱变处理水平。卢银等（2015）认为以0.4%的EMS浸泡种子16 h，以及连续对两代种子进行诱变处理，均可构建大白菜突变体库。黄胜楠（2016）以不同浓度的EMS处理大白菜小孢子胚，发现随着EMS浓度的升高，小孢子胚体的诱导率显著下降，0.08%是EMS诱变处理小孢子胚、创制大白菜突变体的适宜浓度。菜心的长势较油菜和大白菜均弱，因此诱变的浓度降低或诱变的时间缩短。菜心种子EMS诱变处理的最佳条件为0.4% EMS诱变处理12 h。同时可根据诱变材料的生长势进行微调。

本研究采用最佳诱变条件处理3000粒小80天菜心种子，获得了一个包含2110个单株的菜心突变体库。在M1群体中出现黄化、白化、皱缩、矮化及嵌合等变异性状，但这些变异性状大多在M2群体中消失，推测M1群体中出现的某些变异性状是由于EMS药剂伤害所造成，不能稳定遗传。通过对M2群体进行分析，发现M2群体表型变异频率为4.3%，突变频率低。可能是由于突变体的鉴定局限于肉眼进行表型鉴定，且性状调查较简单，尚未进行品质和抗性等重要性状的突变体筛选，因此今后应进一步建立完善的品质、抗性变异材料的筛选体系和评价方法，以期获得更多有益的育种材料和更加全面地评价菜心种子EMS诱变效率和突变规律。EMS突变绝大多数是隐性突变，在M1群体中观察不到表型变异，而需将M1群体植株自交，在M2群体中寻找突变体（李昕等，2020）。诱变后代突变体的鉴定工作量巨大，应辅之分子检测进行筛选，提高突变体检出效率（李浩杰等，2012）。

丰富的种质资源是菜心遗传育种和功能基因组学研究的重要基础，有目的地创新种质资源是菜心遗传育种的关键任务和目标。本研究通过EMS诱变，构建了一个包含2110个单株的菜心突变体库。在全生育期内对M2群体表型进行全面调查，发现叶形、叶色、株型和花色等突变类型，获得紧凑株型、叶色深绿、叶柄变宽和花瓣白色等多个优异突变体。这些突变体可作为新的种质资源或中间材料，为新品种的培育打下基础，也可用于菜心功能基因组的研究。

4 结论

利用EMS诱变菜心种子有明显效果，构建的菜心EMS突变体库表型变异丰富，尤其是出现株型紧凑，叶色浓绿的有益突变，可用于菜心功能基因组学研究和育种。

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（責任编辑 邓慧灵）