结缕草属植物杂交后代形态特征和SRAP分子标记鉴定

叶 刚， 张笑笑， 陈静波， 李建建， 李 玲， 刘建秀， 郭爱桂， 郭海林

(江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)， 江苏 南京 210014)

结缕草属(Zoysia)植物是当前广泛使用的优良暖季型草坪草之一，主要分布于非洲、亚洲和大洋洲的热带和亚热带地区[1]。结缕草属植物有11个种，以及若干变种和变型，各个种在形态、生理、遗传等各方面存在着丰富的变异，这些丰富的遗传资源为杂交育种及性状改良奠定了重要的基础。该草种可适应不同类型的土壤环境，因其具有特定的低维护、耐践踏、抗寒、抗旱、耐盐碱、耐瘠薄、抗病虫害等特性，正日益引起国内外草坪草育种家和相关研究者的关注[2-5]，已广泛应用于运动场草坪、绿地草坪及水土保持草坪等。我国是结缕草属植物分布最丰富、储量最大的国家[6]，但由于我国对草坪草的研究起步较晚，至今培育的新品种非常少，不能完全适应我国地域辽阔、气候类型多样的环境。

杂交育种作为一种传统的重要育种方式，可为优良品种的选育提供更多机会，被植物育种家广泛应用。江苏省中国科学院植物研究所自2000年就开始了结缕草属植物的杂交育种工作，并根据结缕草雌蕊先熟，雄蕊后熟的开花习性，采用不去雄的控制授粉杂交方法，但结缕草属植物雌蕊和雄蕊的开花次序均为从花序顶部到基部依次开花，部分结缕草顶部的花药开裂时，基部的雌蕊还未萎蔫，导致会产生部分自交后代，自交结实率变异范围为0～54%，平均为16.15%[7]，因此采用不去雄的方法进行杂交育种就必须对杂交后代的真实性进行鉴定。

形态学鉴定是最直接、最基础的鉴定方法。结缕草属的杂交后代主要通过生殖性状和营养性状等外部性状来鉴别，生殖性状包括生殖枝高度，穗轴长度，花序长度与宽度，小穗长度和宽度等性状；营养性状包括叶片长度和宽度，节间长度和直径，草层高度、密度等。郭海林[8]的研究表明通过对这些外部性状的调查和测量，可以初步鉴定出结缕草属杂交后代的真实性。只是形态学特征容易受环境条件以及人为因素的影响，不能真实、准确地反应其后代的遗传变异，因而需要借助其他技术手段进行辅助鉴定与验证。分子标记是指可以显示染色体及其片段、基因或某一特定DNA序列在系谱中的传递轨迹的易于检测的遗传物质，是DNA水平遗传多态性的直接反映，受外界环境影响较小，广泛应用于遗传图谱构建、目的基因定位、分子标记辅助育种、植物种质鉴定等诸多领域，并发挥着重大的作用[9-12]。相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)分子标记是基于PCR技术的一种新型分子标记技术，由Li与Quiros于2001年首先开发出来，该标记具有操作简便快速、结果稳定、便于克隆测序目标片段以及成本较低等特点。本课题组在前期工作中建立了结缕草SRAP-PCR优化体系[13]，并将其应用于结缕草属植物的杂种真实性鉴定[14]、遗传多样性研究[15]和遗传图谱构建中[16]，这些研究表明，SRAP分子标记在结缕草属植物研究中具有稳定性好，检出效率高的特点。鉴于此，本研究将在前期工作的基础上，采用形态学标记和SRAP标记技术2种方法同时对结缕草属19个杂交组合的34份杂交后代进行杂种真实性鉴定，从而使试验结果更具有说服力，也为下一步的后代选育及其应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为结缕草属19个杂交组合的27个亲本及其34个杂交后代，34个杂交后代分别于2002年和2004年通过人工控制授粉法杂交获得，目前均种植于江苏省中国科学院植物研究所苗圃(118°28′ E，32°02′ N，海拔30～40 m)。亲本来源、杂交组合和杂交后代信息详见表1和表2。

表1 结缕草属杂交组合的亲本

续表1

表2 结缕草属杂交组合及其后代

1.2 试验方法

1.2.1外部形态鉴定 测量指标：2019年6—7月对27个亲本及其34个后代材料的10个形态指标(包括草层高度、密度，叶片长度和宽度，匍匐茎节间长度和直径，匍匐茎色泽，叶片上下表面茸毛密度和叶舌纤毛密度)进行观测，并对不同组合的后代形态特征与亲本进行比较和方差分析，以初步判断34个杂种的真实性及其与亲本相比的差异性。

测量方法采用郭海林等[8]和周志芳等[17]的方法。

草层高度：指结缕草生长的自然高度，采用五点法进行测量。

密度：指每100 cm2内直立枝的数目，重复测量3次。

叶片长度和宽度：指直立枝上倒3叶完全展开叶的长度和叶片中部宽度，重复测量10次。

匍匐茎节间长度和直径：随机选取健康生长的匍匐茎，测量倒4节的长度和中部位置的直径，重复测量10次。

匍匐茎色泽：采用5级制，绿色为1，黄褐为2，褐色为3，浅紫为4，深紫为5。

叶片上/下表面茸毛密度：目测叶片上/下表面茸毛状况，无或极疏为1，疏为2，密为3。

叶舌纤毛密度：目测叶片叶舌纤毛状况，无或极疏为1，疏为2，密为3。

数据处理和分析：每个参试材料测试的形态指标平均数用Excel 2019软件进行计算，并利用SPSS 26.0软件对每一组合的亲本和后代的每个形态指标进行方差分析和多重比较，从而比较杂交后代和亲本之间的关系，判断其真实性。

1.2.2分子标记鉴定 杂交后代及其亲本基因组DNA的提取和检测：杂交后代及其亲本基因组DNA的提取和检测，采用薛丹丹等[13]和郭海林等[18]的方法。

SRAP引物组合：SRAP引物设计参考Li和Quiros的方法[19]。根据SRAP-PCR反应体系，随机选取7条正向引物和10条反向引物[20，21]，共组合成70对SRAP引物，用于后代的真实性鉴定，其序列见表3。

表3 SRAP引物序列

SRAP-PCR扩增程序及扩增产物的检测：应用杂交亲本材料对SRAP引物组合进行筛选，从中获得具有扩增条带清晰、丰富的父本特征性条带的引物组合，用于杂交后代的真实性鉴定，每一个引物组合重复试验一次。

SRAP-PCR扩增体系为：总体积10 μL，PCR Mix 5.0 μL，2 mmol·L-1引物1.0 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 2.5 μL，PCR Mix购自南京博彩生物科技有限公司，DNA Marker购自南京TaKaRa公司。

SRAP-PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；循环结束后72℃延伸7 min，4℃保存。扩增反应在TC-412型扩增仪(TECHN公司,英国)中进行。

扩增产物的检测：SRAP-PCR反应结束后，在扩增产物中加入2 μL 6×Loading buffer混匀，上样于10%的聚丙烯酰胺凝胶，用240 V电压进行电泳分离约2.0 h(DYY-8B型电泳仪,JY-SCZ6型电泳槽,北京六一)，然后在摇床上进行银染检测，并拍照记录。

杂交后代真实性鉴定：应用表3中引物组合，以清晰稳定的父本特征带为判断依据，分别对各杂交组合进行杂种真实性鉴定，后代扩增结果中具有父本相对于母本的特异型带的即为真杂种，而只具有母本特异条带无父本特征带的后代则为假杂种或自交种。每一特征引物组合重复试验一次，此外还同时用多个引物进行鉴定，最后依据父本特征带对试验结果进行统计。

2 结果与分析

2.1 杂交后代的外部形态鉴定

通过对结缕草属植物19个杂交组合的亲本及其杂交后代的10个外部性状进行观测，并对同一组合的后代与亲本观测结果进行方差分析(表4和5)，结果发现同一组合的不同后代在10个外部性状上存在不同程度的差异，且大部分杂交后代的外部性状与母本或双亲都存在显著性差异。对34个后代的变异和鉴定情况分析如表6所示。由表6可知，根据形态特征，34个后代中除了0402-6，0402-8，0404-4，0404-5因有6个或6个以上的外部性状都与母本无显著性差异可能为假杂种，其余30个杂交后代观测的10个外部性状中至少有5个外部性状与母本存在显著差异，因此初步判断它们为真杂种。

表4 19个杂交组合的外部性状多重比较及变异分析

续表4

续表4

表5 19个杂交组合的形态指标变异范围分析

表6 34个后代的外部性状多重比较及变异分析

续表6

2.2 杂交后代的SRAP分子标记鉴定

以70对SRAP引物对19个杂交组合的杂种真实性从分子标记的角度进行鉴定，以父本相对于母本的清晰的特征带为判定标准。结果发现70对引物中可以用16对引物将34个后代鉴定为真杂种。

首先用引物组合Me1Em1和Me1Em2对全部19个杂交组合的后代进行鉴定，结果0204，0210，0217，0233，0404等5个杂交组合的全部后代在引物Me1Em1中都扩增出各自的父本特征条带，均被鉴定为真杂种，0232，0233，0238等3个杂交组合的后代用引物Me1Em2鉴定为真杂种；然后用引物组合Me1Em3，Me1Em4，Me1Em5，Me1Em6对余下的12个杂交组合进行鉴定，结果引物Me1Em5将0228杂交组合的后代0228-4鉴定为真杂种，引物Me1Em6将0237杂交组合的两个后代鉴定为真杂种；紧接着用Me1Em 7，Me1Em8，Me1Em9等5对引物组合对余下的10个杂交组合进行鉴定，引物Me1Em9在0402，0410，0201，0202，0204，0221，0232，0234，0236，0419共10个组合的父本中扩增出了特异性条带，其中0201，0221，0234，0419四个杂交组合的全部后代都扩增出父本特征条带，被鉴定为真杂种，引物Me1Em7和Me1Em8将0207和0412这2个杂交组合的后代鉴定为真杂种；又用Me5Em9，Me5Em10，Me6Em1，Me6Em2等10对引物组合对余下4个杂交组合进行鉴定，结果Me5Em9，Me5Em10，Me6Em1，Me6Em3，Me6Em6，Me6Em7等6对引物均可以将0202杂交组合的4个后代鉴定为真杂种，而0236杂交组合的3个后代中只有2个后代0236-7，0236-8被Me5Em9和Me6Em1两对引物鉴定为真杂种，0402杂交组合则用Me5Em9和Me6Em2两对引物鉴定为真杂种；最后用Me7Em1，Me7Em2，Me7Em3等10对引物组合对余下2个杂交后代0236-4，0410-3进行鉴定，结果在引物Me7Em5中两个后代材料均扩增出各自的父本特征条带，鉴定为真杂种。据此，34个杂交后代全部鉴定为真杂种。如图1，以引物Me1Em9对其中10个杂交组合后代的鉴定结果为例。对所有亲本杂交组合的后代杂种鉴定结果统计见表7。

图1 Me1Em9对其中10个杂交组合后代的鉴定结果

表7 杂种鉴定结果

3 讨论

3.1 形态特征鉴定

形态学标记因其具有快速、简便，无需昂贵的仪器设备等特点，成为育种者们进行杂种鉴定和遗传多样性研究的重要手段，在芸薹属、菊属、辣椒属、月季、小麦[22-26]等植物中都有较多的报道。本研究通过对亲本和后代的外部性状观测值进行方差分析，结果发现各组合的亲本和后代之间均存在不同程度的差异，且同一组合不同后代的外部性状之间也有较大变异，说明通过杂交育种使结缕草属植物后代产生了基因重组现象，从而导致后代间发生了丰富的变异，进一步为新品种的选育工作提供了基础。由亲本和后代的变异范围可知，不同组合杂交后代的10个外部性状变异范围存在较大的差异，后代变异范围超出亲本的最高达到80%，最小只有20%。利用10个营养性状指标对结缕草属植物19个组合27个亲本和34个后代的变异情况进行了比较分析，结果发现有30个杂交后代的多个外部性状均与父母本存在显著差异，初步判断它们为真杂种，而另外4个后代0402-6，0402-8，0404-4和0404-5分别有6个或6个以上的外部性状与母本无显著性差异，从外部性状上不能确定其为真杂种，必须借助于分子标记等技术手段对其作进一步的鉴定。

3.2 分子标记鉴定

随着生物化学和分子生物学的快速发展，分子标记技术在各个研究领域得到了广泛的应用[8-11]。与形态学鉴定相比较，分子标记技术不受植物正常生理代谢及环境变化的影响，能从遗传物质DNA水平研究植物基因的变化，操作更简单，结果更精确[25]。SRAP分子标记技术具有引物设计简单，通用性高等优良特性，已被广泛应用于多种植物的遗传多样性研究、遗传连锁图谱的构建、基因定位、植物种质鉴定和分子标记辅助育种中，并已在假俭草[27]、海雀稗[28]、狗牙根[29-30]等草坪草的遗传图谱构建、遗传多样性研究、新品系鉴定等研究中发挥了重要作用。本文应用SRAP分子标记技术对来自于19个杂交组合的34个后代进行杂种鉴定，结果表明，全部后代因具有父本的特征带而被鉴定为真杂种。同时，从杂种扩增的条带看，杂种谱带并不是双亲谱带之和，而是出现了新谱带的增加或某些谱带的消失，同一杂交组合中的后代在相同的引物下扩增的条带也不一致，另外，本研究利用不同的SRAP引物对同一组合的后代进行多次鉴定获得了更准确的结果。这些结果均表明结缕草属植物通过杂交育种导致了后代的基因重组，并产生了丰富的变异，这都为杂交后代的选育工作提供了依据。同时杂交后代真实性的鉴定也为进一步选育优良杂交后代奠定了基础。

4 结论

本文通过形态学和分子标记两种鉴定手段对结缕草属植物19个杂交组合的34个后代杂种真实性进行了鉴定。结果表明，形态学鉴定中有30个后代因其在测定的外部性状上与父本无显著差异而与母本有显著差异，因此初步推断其可能为真杂种，而另外4个后代因在外部性状上与母本差异不显著或仅有少数性状与母本有差异，不能确定其是否为真杂种，进而通过SRAP分子标记技术鉴定其杂种的真实性，两种方法的有效结合，最终将34个杂交后代全部鉴定为真杂种，为后续研究和新品种选育奠定了良好的基础。