骆驼奶对TNBS诱导的小鼠急性肠炎的保护作用

崔畅婉，于淼，吴思，王爽，孙峥嵘

(中国医科大学附属盛京医院 生物样本库，沈阳 110001)

骆驼奶中含有丰富的维生素C、不饱和脂肪酸、维生素B以及牛奶中没有的乳铁传递蛋白和溶菌酶等，营养成分含量极高[1]。骆驼奶中含有丰富的与牛奶不同的蛋白质，不会诱发蛋白质过敏症状，对于食用牛奶过敏的人群更为安全[2]。研究表明，骆驼奶能够通过调节Th1型和Th2型细胞比例及细胞因子分泌，纠正失衡的细胞因子网络，在免疫性糖尿病和肝炎等疾病治疗过程中起重要的辅助治疗作用[3-4]。肠黏膜免疫失衡是引起肠道损伤的重要原因之一，在炎症性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)患者肠黏膜组织中有大量Th17浸润，它分泌的IL-17是重要的促炎因素。CTL可直接杀伤靶细胞，在炎症和肿瘤免疫过程中具有重要作用。中性粒细胞(CD11b+Gr1+)、Th以及NK细胞均能合成IL-10，后者抑制单核巨噬细胞的抗原提呈作用，减少巨噬细胞分泌IL-23，进而抑制Th17免疫应答，抑制炎症发生。目前骆驼奶对肠道黏膜免疫细胞分群及其功能是否具有调节作用，能否抑制肠道炎症发生尚不明确。本研究使用2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)诱导小鼠急性肠炎模型，使用骆驼奶灌胃治疗，检测小鼠肠道淋巴细胞亚群、中性粒细胞百分比及细胞因子分泌情况，探讨骆驼奶对小鼠肠炎的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂SPF级BALB/c小鼠24只，6～8周龄，雄性，体质量16～18 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于中国医科大学动物部。骆驼奶粉，购自新疆旺源驼奶实业有限公司；TNBS溶液(2 mg粉末+50%乙醇)，购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养液，购自Gibco公司；Percoll细胞分离液，购自Sigma-Aldrich公司；抗小鼠Gr-1-PE、CD11b-PerCP、F4/80-APC、CD3-PE、CD8α-APC、CD4-FITC、CD44-PE抗体，购自BD公司；IL-10和IL-17 ELISA检测试剂盒，购自R&D公司。

1.2 实验方法

1.2.1 IBD诱导及H-E染色 实验组和对照组采取随机分组方法，每组6只，实验结果由数次实验总结归纳得出。实验组小鼠骆驼奶灌胃0.2 g/(次·只)(奶粉溶于200 μL双蒸水)，对照组小鼠双蒸水灌胃200 μL /(次·只)，灌胃操作持续14 d。第15天对实验组与对照组小鼠施行禁食12 h后，用5 μL/g水合氯醛注射麻醉，保证小鼠不窒息死亡。用灌肠注射器经小鼠肛门给药，TNBS溶液按100 μL/只缓慢注入小鼠直肠，倒挂小鼠5 min，以免漏液。操作持续5 d，第7天处死小鼠，进行后续实验。对小鼠结肠组织切片进行 H-E 染色， 在 400 倍光学显微镜下进行病理学评分并观察炎症细胞浸润情况。

1.2.2 肠黏膜固有层淋巴细胞的分离提取 处死小鼠并剪开小鼠皮肤和黏膜，暴露小鼠腹腔，用镊子轻轻取出小鼠结(直)肠并用生理盐水洗净，之后剪碎并转移至离心管，加RPMI 1640培养液至35 mL，37℃ 培养20 min；用纱布过滤后转移至原来的离心管并离心，弃上清液， 用8 mL 45% 密度梯度分离液重悬，之后缓慢加到装有5 ml 66.6%Percoll离心管并离心；回收上清液并用RPMI 1640培养液稀释。

1.2.3 FACS检测 在提取的小鼠肠黏膜固有层淋巴细胞混悬液中分别加入抗Gr-1-PE、CD11b-PerCP、F4/80-APC、CD3-PE、CD8α-APC和CD4-FITC抗体进行FACS表面染色检测中性粒细胞(CD11b+Gr1+)、巨噬细胞(CD11b+F4/80+)、CD4+和CD8+T细胞百分比。进行胞内染色时，向细胞中加入十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯(phorbol myristate acetate, PMA)(25 ng/mL)、离子霉素(1 μg/mL)以及布雷菲德菌素A(10 μg/mL)，在37 ℃条件下刺激培养5 h后回收细胞进行表面染色，随后破膜固定细胞，再加入胞内抗体染色，4 ℃孵育30min，离心洗涤，重悬沉淀物。进行FACS检测，使用FlowJo 7.6软件分析。

1.2.4 ELISA检测 将浓度为2.0×105个/mL的小鼠肠黏膜固有层淋巴细胞接种于包被抗CD3单克隆抗体的细胞培养板中，并加入稀释好的抗CD28单克隆抗体；培养48 h后回收细胞上清液，加入捕获抗体，室温孵育过夜；第2天用封闭液封闭；洗涤并分别加入标准品和样品，室温避光孵育2 h；洗涤后加入检测抗体，室温避光孵育；加入辣根过氧化物酶标记物，最后加入底物，室温避光反应20 min；加入终止液终止反应，上机检测样品光密度D(450 nm)及D(630 nm)。

2 结果

2.1 小鼠肠组织及H-E染色实验组和对照组小鼠体质量均下降，但实验组小鼠下降缓慢，小鼠肠管缩窄减轻，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。取小鼠结(直)肠组织切片行H-E染色，镜下观察均显示上皮结构不完整，隐窝消失及炎症细胞浸润，但实验组小鼠在组织学评分方面比对照组低，且差异有统计学意义(P<0.05)。(图1)

注：与双蒸水对照组相比，*P<0.05。

2.2 小鼠肠黏膜固有层淋巴细胞亚群百分比和细胞绝对数分析T细胞亚群时，在原始FSC-SSC图中圈门淋巴细胞，以CD3为横坐标，圈门CD3+细胞，并以CD4为横轴、CD8α为纵轴分析CD4+、CD8+T细胞亚群百分比。分析中性粒细胞时，圈门CD11b+细胞，并以F4/80为横轴、Gr-1为纵轴分析中性粒细胞(CD11b+Gr-1+)和巨噬细胞亚群(CD11b+F4/80+)百分比。分析Th17亚群时，圈门淋巴细胞后，圈出CD4+淋巴细胞，并以IL-17为横轴、CD44为纵轴分析Th17亚群百分比。FACS胞外染色结果显示，与对照组小鼠比较，实验组小鼠的肠道黏膜细胞中CD11b+Gr1+细胞百分比升高(P<0.05)，CD8+T细胞百分比下降(P<0.05)。FACS胞内染色结果显示，与对照组相比，实验组小鼠肠道黏膜免疫细胞中IL-17+CD4+T细胞即Th17百分比降低(P<0.05)，表明骆驼奶能够调节小鼠肠道黏膜免疫细胞的百分比，诱导T细胞分化，抑制CD8+T细胞增殖(图2)。骆驼奶对小鼠TNBS诱导的急性肠炎保护作用可能与免疫调节有关。

注：与双蒸水对照组相比，*P<0.05。

2.3 小鼠肠上皮细胞培养上清液中细胞因子水平ELISA检测结果表明，与对照组相比，实验组小鼠肠道黏膜固有层淋巴细胞培养上清液中IL-17水平下降，IL-10水平升高(P<0.05)，提示骆驼奶对TNBS诱导的小鼠肠道炎症细胞的作用可能是通过抑制IL-17和促进IL-10的分泌完成的(图3)。

注：与双蒸水对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

近年来，IBD的发病呈升高和年轻化趋势，其发病机制涉及饮食、吸烟、遗传、环境、免疫等多种因素。IBD典型发病症状包括腹痛、腹泻、血便等，严重损害患者生活质量。IBD的发病机制与Th1/Th2细胞比例失衡和细胞因子分泌异常密不可分，Th17在肠炎发展中的作用也至关重要。Th17可释放多种细胞因子如IL-17A、IL-17F、IL-21等，加重组织炎症反应，并促进IBD的发生与发展[5]。骆驼奶具有潜在的医用价值，其所含有的类胰岛素不易被胃酸破坏，并可增加患者血清中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。骆驼奶中的不饱和脂肪酸尤其是亚麻酸含量明显高于牛奶，1型糖尿病患者规律饮用骆驼奶后，需要胰岛素的注射剂量明显减低[4， 6]。骆驼奶中含有抗肿瘤活性成分，对乳腺癌、结直肠癌等肿瘤细胞增殖具有抑制作用[7-8]。IBD发病机制的研究基于小鼠、大鼠等动物模型，构建适宜的动物模型对研究其发病机制及病程进展十分重要。目前，建立IBD动物模型应用最广泛的方法是通过外源化学物质诱导，包括恶唑酮、TNBS及葡聚糖硫酸钠[9-10]。本研究以TNBS诱导的BALB/c小鼠肠炎模型为研究对象，模拟人肠道环境，探究骆驼奶对肠道黏膜免疫细胞增殖和细胞因子分泌的影响，进一步探究骆驼奶对TNBS诱导小鼠肠炎的保护作用。

研究发现，与双蒸水对照组相比，骆驼奶实验组小鼠体质量下降缓慢，组织学评分低，表明骆驼奶对TNBS诱导的小鼠急性肠炎有保护作用。FACS结果显示骆驼奶能有效抑制肠炎模型中小鼠CD8+T细胞亚群百分比，抑制IL-17的分泌。CD8+T细胞是CTL亚群，具有杀伤功能，有促进肠炎进展的作用。IBD患者的结肠组织中Th17比例升高，而Th17分泌IL-17参与结肠黏膜病理损伤，诱导上皮细胞分泌IL-6、IL-8、前列腺素E2等炎性因子，募集中性粒细胞。在炎症后期，IL-17促进Th分化和趋化因子生成，加重组织损伤[11-12]。骆驼奶灌胃后，CD8+T细胞亚群百分比下降，IL-17浓度降低，说明骆驼奶对小鼠急性肠炎具有保护作用。目前已知并非只有特定的T细胞亚群才能合成IL-10，几乎所有淋巴细胞均能合成IL-10。CD11b+Gr1+中性粒细胞也能合成IL-10，骆驼奶灌胃后中性粒细胞百分比增加，而ELISA结果显示小鼠肠黏膜固有层细胞分泌IL-17水平降低，而IL-10升高。IL-10作为潜在的抑炎因子，在人胃肠道稳态维持过程中起重要作用。有研究表明， 小鼠体内IL-10缺乏会诱发自发性IBD，其发病机制与Th介导的炎症反应有关[13]。骆驼奶灌胃后，小鼠体内IL-10水平增高而IL-17下降说明骆驼奶能够调节小鼠肠道细胞因子分泌，这为骆驼奶辅助临床治疗IBD提供新的可能性。

综上所述，骆驼奶对TNBS诱导的小鼠急性肠炎具有保护作用，该作用可能与免疫调节有关。骆驼奶可以抑制CD8+T细胞增殖，减少IL-17的分泌，同时促进IL-10的分泌。进一步探究骆驼奶在IBD中的保护作用是接下来的研究方向。