城市污水中菌群检测方法的比较

车逍宇

（调兵山信环水务有限公司，辽宁调兵山 112700）

粪大肠菌群属于大肠菌群的一类，将其作为卫生学的指标，代表性更突出。目前，粪大肠菌群被认为是水体受粪便污染的最实用的指标菌。如果水体中含有肠道病原菌株，饮用后会引起严重疾病，如泌尿系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株可引起急性腹泻。采用科学的、准确的、精准的粪大肠菌群检查方法，有助于全面监控水域粪大肠菌群的污染情况，为预防与控制疾病的传播与发展起到积极的指导作用。2021年5月31日，取调兵山污水厂的出水水样至菌采样袋中，放入经过消毒的采样桶。

1 粪大肠菌群的检测方法

1.1 多管发酵法

多管发酵法利用大肠菌群可以产酸及产生气体的原理，发酵乳糖，引起紫色的乳糖蛋白胨蛋白液的颜色发生变化，小玻璃导管内产生气泡。

（1）初发酵试验。

在装有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中接入水样，温度控制在（37±0.5）℃，培养（24±2）h，如果发酵管中出现产酸产气，说明结果为阳性。发酵罐内产气情况不显著，通过轻轻拍打试管，查看是否有小气泡，有气泡则为阳性，反之为阴性。

（2）复发酵试验。

轻轻摇荡初发酵试验阳性结果的发酵管，采用灭菌棒或接种环，将其转接到EC培养液。在温度（44.5±0.5）℃条件下，继续培养（24±2）h。接种后，全部发酵管放入水浴锅中水浴，时间控制在30 min。培养结束后，观察培养管，若有气体产生，则可以确定为阳性结果。

根据接种量确定的阳性结果数量，通过MNP表查询对应的指数数据，将MPN值乘以10，即为1 L水样中的粪大肠菌群数。

1.2 滤膜法

采用0.45 μm孔径的微孔滤膜对水样进行过滤处理，滤膜吸附细菌，将滤膜转移到选择培养基上进行培养，对生长出的大肠菌群菌落数进行计数。

（1）过滤水样。

采用无菌镊子从灭菌滤膜的边缘位置处夹起，光滑面朝下贴放到滤床上，并将滤器固定；在滤器中注入适量的水样，盖上盖子启动真空泵，开始除菌抽滤。

（2）培养。

过滤完水样继续抽5 s再关闭真空泵，将滤器取下，用灭菌后的镊子从菌滤膜边缘部分夹起，转移到M-FC培养基上，截留细菌一面朝上放置，滤膜和培养基应贴合紧密。将平皿盖好，倒放入恒温培养中培养（24±2）h，培养温度设置为（44.5±0.5）℃。

计数及报告结果：采用放大镜或直接肉眼查看典型菌落数，在M－FC培养基上生长的粪大肠杆菌均为蓝绿色或者蓝色；其他菌种为无色、灰色或淡黄色。计数典型粪大肠菌群数，并计算出每升水样中的数量。

1.3 纸片快速法

（1）概念。

纸片快速法以胶片、纸片及纸膜作为培养基载体，载体上附着特定的培养基和显色物质，粪大肠杆菌群生长在上面，显示出对应的颜色，由此判定菌群的数量；在纸片培养基上，粪大肠菌显示为红色，周边会出现黄圈，这是由于粪大肠菌分解乳糖产生了酸类位置，引起指示剂发生变色反应。

（2）检测方法。

每份预监测水样接种水样总量为55.5 mL，分别接种5张大纸片，每张接种10 mL水样；接种10张小纸片，5张小纸片每张各接种1 mL。

将1 mL的1∶10稀释水样接种到另外5张小纸片上，放入培养箱培养18～24 h，温度控制在（44.5±1）℃；依照阳性纸片数量，查MNP表，得出最终的结果。

1.4 酶底物法

（1）概念。

酶底物法分析水样中的粪大肠菌群数的原理是依据其可以产生β—半乳糖苷酶，分解P邻硝基苯—β—D—半乳派喃糖，导致培养液呈现为黄色。

（2）检测方法。

酶底物法以MPN法为基础，采用51孔定量的方式。采用100 mL的无菌稀释瓶量取样，再加入Colilert试剂，摇晃均匀直到完全溶解，将水样全部转移到5l孔无菌定量盘中，程控定量封口机Sealer封口处放置定量盘。

培养24 h，温度控制在44.5 ℃。孔穴内的水样变为黄色，说明其中有大肠菌群，通过查表可以得到代表的粪大肠菌群数。

2 常见检测方法比较

目前，常用于检测粪大肠菌群的方法有两种，分别为多管发酵法和滤膜法。其缺点是步骤较多、时间长、干扰因素较多且需要确认试验；只能分析少量的样品，无法快速评价水的卫生学状况。

传统方法的优点在于原理简单、费用低、易推广，因此在常规监控中经常使用传统方法。

国家环保标准《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》（HJ 755—2015）（简称“纸片法”）和酶底物法，整个检测周期只需要18～24 h，结果稳定可靠、易于操作，且不需要确认试验。滤膜法还能够评价水中大肠埃希菌、大肠杆菌的污染情况。

目前世界各国常采用的检测方法如表1所示。

表1 粪大肠菌群各检测方法的比较

3 结语

现阶段，已有分子生物学方法用于检测大肠菌群，其具有准确、快速等优点。随着检测技术水平的不断提高，其应用的普及度主要受到技术操作难易程度、检测设备、检测成本、环境等多个方面的影响。为全面普及分子检测方法，还需要通过长期的验证与探索，不断改进与优化，以提高技术的精准性，实现技术的全面推广。纸片法、酶底法两种检测方法的优点在于检测周期短、易于操作等，其会逐步替代传统的滤膜法和多管发酵法，其中酶底物法应用了密封培养等手段，能够有效规避病菌感染检测人员的问题出现。酶底物法应用价值更高，未来在评价水质微生物方面，可将其作为一种标准的、快速的检测方法。未来监控工作将会朝着自动化检测的方向发展，一些新方法、新仪器也会得到应用与推广。