基于网络药理学探讨赤芍-白芍药对治疗系统性红斑狼疮的作用机制

李坤淋，周豪坤，李全鑫，李 杨

(1.重庆医科大学 中医药学院，重庆 400016；2.浙江中医药大学 基础医学院，浙江 杭州 310053；3.重庆市北碚区中医院，重庆 400700)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及全身的多系统、多脏器、病程迁延反复的慢性自身免疫性疾病，多发于育龄期女性，属结缔组织病范畴[1]。近几十年来，该病的治疗取得了一定进展，但是目前可用的药物如糖皮质激素等尚不能很好地控制疾病，并且常受到脱靶效应的限制[2]。中医古籍对本病早有记载，古代医家多根据其临床表现及特征将其命名为“面游风”“茱萸丹”“马缨丹”等，中医药治疗该病具有一定特色和优势，运用恰当的治疗方法，可大大减少药物产生的副反应，提高疗效。

芍药之名始载于《神农本草经》[3]，经历代医家发展运用，后逐渐分化为赤芍与白芍两种，均为临床常用中药。赤芍、 白芍虽为两种药物，但性味相近，且来源皆为毛茛科芍药的干燥根，二者化学成分有诸多相似之处，由于原植物生长环境、药材加工方法以及饮片炮制工艺等方面的不同，所以导致功用各有偏重[4]。现代研究表明，在临床治疗系统性红斑狼疮方面，赤白二芍不论是单用或是合用都可在多个环节影响系统性红斑狼疮的细胞免疫、体液免疫以及炎症过程，取得较好疗效[5-6]。

网络药理学是基于网络生物学基础，结合现有的多药理学基础，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点对多靶点药物分子设计的一门新型学科[7]。而网络药理学系统性、整体性的网络研究理念与中药复方“多成分、多层次、多靶点、多通路”的调节模式和作用特点相似，为中医中药“病-证-方”研究提供了新技术与方法[8]。运用网络药理学研究方法，本研究深入探讨了赤芍、白芍治疗系统性红斑狼疮的潜在作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 赤芍-白芍药对有效活性成分的挖掘与筛选

利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)进行成分的查询及筛选，分别以“赤芍”“白芍”作为检索条件，得到各自相应成分，再进行ADME参数设置，以口服吸收利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18作为筛选条件，结合文献学研究方法，获取赤芍、白芍的有效活性成分。

1.2 活性成分作用靶点预测

将收集到的有效活性成分的化学名分别输入PubChem数据库，即有机小分子生物活性数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，以获得其SMILE结构。对于PubChem数据库中没有收录的成分，则先在TCMSP数据库中下载该化合物的MOL2结构文件，再将MOL2文件键入到在线计算网站ALOGPS 2.1(Computational Chemistry Laboratory，http：//www.vcclab.org/lab/alogps)进行SMILE结构的计算，以获取该化合物的SMILE结构。将得到的SMILE结构整合后，分别输入SwissTargetPrediction数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)进行有效成分靶点预测，剔除没有预测靶点的成分，从而获取芍药的潜在生物学靶点及靶点的相关信息。

1.3 系统性红斑狼疮疾病靶点获取

主要利用TTD和Drugbank两个数据库。在TTD(https：//db.idrblab.org/ttd/)数据库网页上下载“TTD all target date”和“TTD 自转UNIPROT ID”文件，利用excel的查找和筛选功能，获得系统性红斑狼疮的部分相应靶点和Uniprot号。在Drugbank数据库的网页检索框中输入“systemic lupuseryth ematosus”，获得SLE靶点的名称，再借助Uniprot数据库的“Retrieve/ID mapping”功能，将获得的靶点名称校正为Uniprot号，以便后期数据统计和处理。将两个数据库获得的靶点整合，得到系统性红斑狼疮相应的疾病靶点。

1.4 赤芍、白芍成分-靶点网络构建及拓扑分析

将上述获得的成分靶点和疾病靶点通过Uniprot号进行映射，得到二者的交集靶点，再借助Uniprot数据库的“Retrieve/ID mapping”功能将这些靶点的Uniprot号校正为基因名，从而解决药物靶点存在的名称不规范等问题。把得到的有效活性成分和基因名称用Excel进行整合，绘制成分疾病靶点三列表，将其导入Cytoscape3.6.0软件，建立“成分-靶点”网络关系图。在该网络图中，Node(节点)表示活性成分和靶点，Edge(边)表示成分与靶点相互作用的关系。并借助Cytoscape3.6.0软件中的Network Analyzer功能进行网络拓扑分析来评价活性成分和靶点的重要性。

1.5 Metascape基因列表分析

Metascape数据库(http：//metascape.org/)可提供自动化元分析工具和一键式Express Analysis输出，并支持基于BioGrid(https：//thebiogrid.org/)的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析，基因本体论(GO)网络的交互式可视化和富集热图生成[9]。将前面得到的映射靶点名称键入到Metascape的输入框中创建基因列表，物种选择为“Homo Sapiens”，点击Express Analysis得到Metascape基因列表分析报告的各项输出结果。

2 结果

2.1 赤芍、白芍有效活性成分

通过检索TCMSP数据库以及相关文献报道[10-11]，剔除无预测靶点的活性成分，最终得到包括芍药苷、单萜糖苷在内的21种重要有效活性成分，其中赤芍16个，白芍8个，二者共同有效成分3个，分别是谷甾醇、β-谷固醇和芍药苷，说明二芍之间具有一定的协同作用。结果见表1。

表1 赤芍、白芍的有效活性成分

2.2 芍药活性成分作用靶点预测和SLE疾病靶点

将通过PubChem数据库或通过ALOGPS 2.1计算所得的有效成分的SMILE结构输入到SwissTargetPrediction数据库预测作用靶点，经过Excel去重总计得到成分靶点608个。借助TTD和Drugbank两个数据库，整理得到疾病靶点总计114个。将成分靶点和疾病靶点进行映射，得到二者交集靶点38个，说明这些靶点为赤芍、白芍直接作用于SLE的靶点。见表2。

2.3 成分-靶点网络的构建及拓扑分析

将得到的芍药有效成分与交集靶点数据输入到Excel中构建成分靶点关系三列表，将其导入Cytoscape 3.6.0软件绘制成分-靶点网络图，在该网络中，节点代表成分和交集靶点，边代表二者之间的关系，总计得到59个节点，170条边，见图1。借助Cytoscape 3.6.0件中的Network Analyzer功能对网络进行拓扑分析，发现其中Degree值靠前的5个成分分别是δ(7)-甾烯醇、喜树碱、桦木酸、菠菜甾醇和黄芩素，其Degree值分别为12、12、12、11、10。而Degree值前5的靶点为CYP19A1、BCHE、PTGS2、ABCB1和CYP2C19，其Degree值分别为14、12、11、11、9。

表 2 芍药与SLE的交集靶点

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析

将得到的38个交集靶点的基因名输入到Metascape数据库进行基因列表分析，从报告中提取蛋白质相互作用富集分析的CYS文件，导入到Cytoscape3.6.0软件进行网络拓扑分析。该PPI网络总共包含27个节点，54条边，分为3个模块，见图2。网络拓扑分析显示Degree值排名靠前的5个靶点为CYP3A4、CYP2C9、HSPA5、MAPK3、和CYP2C19，说明这些靶点在PPI网络中具有重要作用，提示这些靶点在芍药调控SLE的作用中具有较大意义。应用分子复合物检测(MCODE)算法识别提取富集程度较高的2个子网络组件，见图3。MCODE子网络组件1主要参与的生物过程为细胞色素P450-底物型排列、Ⅰ-化合物的官能化和类固醇代谢过程；MCODE子网络组件2主要参与的生物过程为细胞对饥饿的反应、细胞对金属离子的反应和饥饿反应，见表3。

图 3 MCODE子网络

表3 相应组件的功能描述

2.5 基因本体论(GO)分析和KEGG富集热图

提取Metascape基因列表分析中的GO分析和KEGG通路分析，在该分析报告中，采用了基于累积的超几何分布计算P值，并使用Banjamini-Hochberg程序计算q值以说明多次测试[12]，从而收集P值<0.01，最小计数为3，富集因子>1.5的术语。GO分析显示，这些靶点主要参与的生物过程有类固醇代谢过程、对外源刺激的反应、对细菌起源分子的反应等；KEGG通路分析表明这些靶点基因主要参与调控的通路有抗叶酸抵抗、ABC转运蛋白和卵巢类固醇生成等通路，见表4。挑选具有代表性的富集术语的前20个集群构建条形图以更好地展示他们之间的联系，见图4。为了进一步捕获术语之间的关系，Metascape选择了富集术语的子集并将其呈现为网络图，将其中相似性>0.3的术语通过边连接。从20个聚类中的每个聚类中选择具有最佳P值的项，并限制每个聚类不超过15个项，且合计不超过250个。将CYS文件导入Cytoscape3.6.0软件对标签进行着色调整，见图5。

图4 按P值大小着色的富集术语条形图

表 4 GO分析和KEGG通路分析富集结果

3 讨论

目前对SLE的治疗目标主要为控制疾病活动、减少合并症和药物毒性，以确保患者能够长期存活，并防止器官损伤，从而改善患者生活质量[13]。中医药讲究“整体观”诊疗模式，对SLE患者的管理具有独特优势，可显著提高患者预后和生活质量。二芍自古便是中医医师常用药物，白芍柔肝止痛、平抑肝阳；赤芍清热凉血、散瘀止痛，均可用于系统性红斑狼疮的对症治疗。

注：(a)用集群ID着色，其中共享相同集群ID的节点通常彼此靠近；(b)用P值着色，其中包含更多基因的术语倾向于具有更重要的P值。

本次研究共筛选出21种重要有效活性成分，网络拓扑分析显示，δ(7)-甾烯醇、喜树碱、桦木酸等有效成分的Degree值较高，说明这些化合物具有重要的调节作用。例如桦木酸能提高机体的抗氧化能力、增强免疫力，在机体的抗氧化损伤和免疫调节过程中发挥着重要作用[14]。而喜树碱作为世界上第三大植物抗癌药，喜树碱及其多种衍生物对于免疫调节亦具有较好疗效，羟基喜树可碱通过降低Dnmt1基因表达水平，下调p16基因启动子的甲基化水平，从而增加SLE患者单个核细胞(PBMC)中p16表达水平[15]。加用白芍总苷治疗SLE患者时可明显改善患者相关症状和免疫功能[16]。本研究发现芍药苷作为二芍的共同化合物，亦具有重要的调节作用，而芍药苷在白芍总苷中往往占到90%以上，从而进一步验证了二芍对于SLE的疗效。

PPI网络分析显示，Degree值较高的靶点有CYP3A4、HSPA5、MAPK3等。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，对参与T细胞信号转导和自身免疫反应具有重要作用[17]。SLE患者外周血单个核细胞(PBMCs)的磷蛋白组学分析显示，MAPK通路含差异的磷酸化位点最多[18]，说明MAPK相关靶点在SLE疾病的调控中发挥着重要作用。

根据GO分析可以得知，二芍主要通过参与调节免疫、控制炎症等过程进行调控。MCODE子网络显示，P值最高的生物学过程为细胞色素P450-底物型排列，细胞色素P450酶中的CYP2E1与脑部疾病的关系密切，SLE患者常合并神经系统病变如昏迷、脑卒中等，因此可以推测在针对治疗有脑部病变的SLE患者时，配伍二芍进行治疗或许可以取得一定疗效。

KEGG通路富集分析表明，赤芍、白芍主要通过抗叶酸抵抗、ABC 转运蛋白、癌症MicroRNAs、卵巢类固醇生成等通路参与调控，发挥其抗SLE作用。叶酸对于DNA复制至关重要，细胞内叶酸辅因子在炎性自身免疫性疾病和癌症生物学中具有重要作用，说明该通路对于SLE的调节较为重要。ATP结合盒(ABC)转运蛋白催化转运反应，例如微量营养素对细菌的高亲和力吸收以及细胞毒性化合物从哺乳动物细胞中的输出[19]。有研究表明，血清P-糖蛋白水平与SLE与疾病活动性之间具有一定联系[20]，可见通过调控该蛋白通路，可以影响SLE的疾病活动度。

综上所述，赤芍、白芍对于SLE的调控具有多成分、多靶点、多通路、多层次的特点。本研究总计得到21种有效活性成分、38个作用靶点、相关生物学过程14个、相关通路6条，有些靶点或通路已被证实在SLE的发挥中具有重要作用。但通过网络药理学研究方法仍具有一定限制，可能存在忽视二芍配伍前后的活性成分差异、作用靶点的功能还需要实验验证支持等。因此，本研究为中药二芍的研究提供了预测性思路，可为今后设计体内体外验证试验提供参考。