不同类型呼吸道上皮细胞感染金黄色葡萄球菌的基因表达差异研究

尹 僖，谢 伟

(重庆医科大学附属儿童医院核医学科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿科学重庆市重点实验室/重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地，重庆 400014)

感染性疾病是全球引起人类死亡的第二大主要原因，而金黄色葡萄球菌是引起人类感染[1]，尤其是呼吸道感染的主要病原体之一[2-3]。金黄色葡萄球菌是一种可寄生于宿主体表的条件致病菌，同时也是引起局部化脓性感染、肺炎、心内膜炎及全身脓毒血症等医院获得性感染的主要致病菌[4]。α溶血毒素(Hla)是一种外毒素，通常由致病性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产生[5]。Hla可促使中性粒细胞裂解，损伤上皮细胞而产生生物学效应，引起菌血症等临床症状[6]。呼吸道上皮作为宿主对抗细菌感染的第一道防线，研究其在感染条件下发生的变化对于理解宿主-细胞的相互作用非常关键。人支气管上皮细胞株16HBE14o-是一种对Hla敏感的细胞株，而人支气管上皮细胞株S9则对Hla不敏感[7]。对比研究这2种细胞株，对研究Hla在金黄色葡萄球菌感染时对呼吸道上皮细胞的作用具有重要意义。

表达谱芯片可以同时研究组织的数万个基因表达情况，在全基因组层面对细胞的基因表达变化进行全面化较，寻找与感染相关的各种基因。美国国立卫生研究院生物信息中的基因芯片数据库(GEO)是当今最大、最全面的公共基因表达谱数据库，至今已经收集100多万个样本的表达谱原始数据。从不同的角度对数据进行再分析，可以让这些数据获得更大的使用价值，也可减少不必要的重复研究[8-9]。为发现在病原体-宿主相互作用中起关键作用的基因，本研究将从GEO数据库下载的不同呼吸道上皮细胞在不同类型金黄色葡萄球菌感染的表达谱芯片进行分析，旨在寻找差异表达基因，并对其进行基因本体论分析，然后通过通路分析方法筛选出金黄色葡萄球菌感染中的相关通路。另外，通过提取差异通路中的基因，进行基因产物蛋白互作的分析，找到维持上述通路关键的节点基因。现报道如下。

1 材料与方法

1.1一般材料 从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索下载不同呼吸道上皮细胞在不同类型金黄色葡萄球菌感染的表达谱芯片数据，登录号为GSE65018[10]。该数据集包括对金黄色葡萄球菌Hla毒素敏感的细胞株16HBE14o-和对Hla毒素抵抗的细胞株S9，分别用表达/非表达Hla毒素的金黄色葡萄球菌感染。

1.2方法 利用在线基因分析系统(https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)对数据进行统计学处理。对通过过滤标准的基因进行非配对样本t检验，利用Class comparison工具对2组样本分类对比，找到差异表达基因，以P<0.05为差异有统计学意义。利用DAVID在线分析系统(https://david.ncifcrf.gov/)对差异表达基因进行GO本体分析。

2 结 果

2.1基本情况 根据预先设定的数据标准化过滤要求，16HBE14o-组共有1 164个基因，S9组有201个基因通过了过滤标准，可用于进一步生物信息学分析。

2.2差异表达分析 应用在线基因分析系统的差异表达分析工具，分类比较差异显著的基因(P<0.05，变化倍数大于2倍)，分别筛选出50个在16HBE14o-和S9中，表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌感染时差异表达最显著的基因。在S9感染表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌时，50个差异最显著的基因中，有24个基因表达上调，26个基因表达下调。在16HBE14o-感染表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌时，50个差异最显著的基因中，有9个基因表达上调，41个基因表达下调。

2.3差异基因的GO分析 DAVID在线分析系统对差异基因进行基因本体论GO分析结果，见表1、2。

表1 S9细胞株中与Hla毒素相关的GO分析

续表1 S9细胞株中与Hla毒素相关的GO分析

表2 16HBE14o-细胞株中与Hla毒素相关的GO分析

续表2 16HBE14o-细胞株中与Hla毒素相关的GO分析

2.4差异基因的通路分析 使用在线基因分析系统的Pthway Relation Network功能，通过KEGG数据库分析2组细胞感染实验中差异基因的信号通路。结果显示，对Hla毒素非敏感的S9细胞株中，发现差异基因相关的信号通路主要为MAPK、JAK/STAT及Toll样受体通路等与免疫反应关系密切。而16HBE14o-细胞株中与Hla毒素相关的信号通路结果显示，受体通路等与免疫反应无特异相关性。

2.5差异基因的蛋白互作分析 使用STRING功能，通过在线网络http://www.string-db.org/数据库分析2组细胞感染实验中差异基因的蛋白互作情况。S9细胞株中表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌感染时的差异基因蛋白互作分析结果显示，其主要与FOS蛋白、EGR1蛋白、DUSP1蛋白、ATF3蛋白作用联系紧密。16HBE14o-细胞株中表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌感染时的差异基因蛋白互作分析结果显示，其与蛋白作用不大。

3 讨 论

本研究从16HBE14o-和S9细胞株感染表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌的基因芯片数据中，分别筛选出1 164个和201个显著差异(差异大于1.5倍)的基因，并对这些基因进行了基因本体论和信号通路分析。2种细胞株在感染条件下的差异基因数量上区别较大，可能是由于2种细胞株对Hla毒素的敏感度不同所导致。说明细菌因子与气道上皮细胞的相互作用可能具有高度的细胞类型特异性，这与文献[11]报道内容一致。基因本体论分析发现，差异基因主要与转录调控、信号转导、炎性反应及免疫反应等有关，这与公认的感染免疫相关基因本体一致[8-9]。

值得注意的是，在对Hla毒素非敏感的S9细胞株中，与差异基因相关的基因本体包括细胞对脂多糖的反应，这一现象可能是由于差异基因的重叠性所致。信号通路分析发现，差异基因相关的信号通路主要为MAPK、JAK/STAT及Toll样受体通路等与免疫反应关系密切的信号通路，这也与公认的金黄色葡萄球菌感染中被激活的信号通路相一致[12-13]。进一步证明，Hla是金黄色葡萄球菌的主要效应毒素。S9细胞株中，表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌感染时的差异基因蛋白互作分析结果显示，其主要与FOS蛋白、EGR1蛋白、DUSP1蛋白、ATF3蛋白作用联系紧密；而16HBE14o-细胞株中，表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌感染时的差异基因蛋白互作分析结果显示，其与蛋白作用不大。这提示S9细胞可能对Hla诱导的细胞膜损伤具有更高水平的抵抗力,与文献报道一致[14]。

本研究运用生物信息学的方法分析基因芯片数据，16HBE14o-和S9细胞株中，表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌感染时基因表达差异显著；S9细胞株蛋白互作联系紧密。