硫化氢对氧糖剥夺/复氧神经元细胞自噬和凋亡的作用研究

蒋文武，洪岳，邬力祥，邓吕红

1.南方医科大学第五附属医院神经外科，广州 510920；2.中南大学基础医学院生理学系，长沙 410013；3.南华大学附属第一医院神经外科，湖南 衡阳 421001；4.南方医科大学第五附属医院眼科，广州 510920

脑卒中是全球成人死亡和永久性致残的主要原因，60%～80%的脑卒中患者是由于急性血管阻塞所致，由于缺血缺氧导致神经元不可逆损伤，伴随患者神经系统功能损伤，甚至死亡。其中缺血再灌注损伤对脑卒中的作用引起了学者的长期关注[1]。研究显示自噬在脑缺血再灌注损伤中具有多重作用[2]。自噬是一种高度保守的生物现象，参与炎症、肿瘤和神经系统疾病等多种疾病[3]。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是继一氧化碳和一氧化氮之后被发现的第3种气体信号分子，机体内有完备的内源性H2S生成机制。H2S参与调节线粒体功能、细胞氧化还原状态，发挥多种保护作用。H2S生成障碍可引起多种疾病，例如肝损伤、肾损伤以及神经系统疾病[4,5]。本组既往研究证明外源性H2S可以减轻大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）引起的脑缺血再灌注损伤，并在离体实验中初步观察到外源性H2S可以减轻氧糖剥夺-复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）引起的神经元细胞的凋亡[6]，但其具体机制尚未阐述清楚。磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是细胞内高度保守的能量状态的感受器，是参与维持细胞能量代谢稳态的一种重要的信号分子[7]。研究报道AMPK可以通过mTOR调控细胞的自噬过程[8]。AMPK对mTOR活性的抑制参与低氧诱导的细胞自噬的激活[9]，可能在缺血再灌注诱导的组织损伤中扮演着重要的角色[7,10]。本研究进一步探讨外源性H2S是否通过AMPK/mTOR通路抑制自噬从而减轻OGD/R诱导的神经元细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 AMPK过表达质粒（上海吉凯基因）、Opti-MEM（Gibco，美国）、Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）、RPMI-1640培养基（Gibco，美国）、胎牛血清（Gibco，美国）、TRIzol（Invitrogen，美国）、逆转录试剂盒（Fermentas，美国）、Taq PCR Mix（The rmo，美国）、PVDF膜（Millipore，美国）、p-AMPK一抗（武汉三鹰）、AMPK一抗（武汉三鹰）、p-mTOR一抗（CST，美国）、mTOR一抗（CST，美国）、p62一抗（CST，美国）、cleaved caspase 3一抗（Abcam，美国）、β-actin一抗（Abcam，美国）、ECL发光试剂（Millipore，美国）、caspase3活性检测试剂盒（Promega，美国）。

1.1.2 主要仪器 Real time-PCR仪（Bio-Rad，美国）、全自动多功能酶标仪（The rmo Scientific，USA）、倒置显微镜（Nikon，日本）、CO2恒温细胞培养箱（IT61，日本）、凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）。

1.2 方法

1.2.1 神经元细胞PC12培养 大鼠神经元细胞PC12细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。细胞培养于含5%CO2的37℃培养箱中。

1.2.2 细胞分组处理 探讨H2S对OGD/R诱导的大鼠神经元损伤机制时，分为正常组、OGD/R组和（OGD/R+NaHS）组，其中（OGD/R+NaHS）组在操作中增加NaHS（100μmol/L）。探讨AMPK在H2S减轻OGD/R诱导的大鼠神经元损伤时，分为转染对照质粒组、转染AMPK过表达质粒组，（转染对照质粒+OGD/R）组，以及（转染AMPK过表达质粒组+OGD/R）组。

1.2.3 OGD/R模型建立 根据文献报道[11]，PC12细胞更换为无糖D-Hank’s液后，置于密闭盒子内，快速充入95%N2和5%CO2的混合气体，重复3次后置于37℃恒温箱中进行氧糖剥夺4 h；随后将细胞培养基更换成含血清的RPMI-1640培养基，置于常规含5%CO2的37℃培养箱中继续培养，24 h后收集细胞进行后续检测。

1.2.4 AMPK过表达质粒转染 PC12细胞接种于12孔培养板，采用不含双抗的培养基培养，待细胞融合至50%左右，取0.8 g质粒与50 L Opti-MEM混合，室温下温育5 min。将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取1 L Lipofectamine 2000试剂在另一管中与50 L Opti-MEM混合，室温下温育5 min。把稀释后的质粒与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀。室温放置20 min后加入培养细胞。4 h后，更换新鲜含血清的培养基继续培养72 h。转染后细胞可进行后续实验。

1.2.5 real-time PCR检测基因表达 PC12细胞处理后，采用TRIzol裂解，并按照说明书提取细胞总RNA，取1μg总RNA逆转录为cDNA，并以此为模板采用real-time PCR法检测目的基因的表达。根据各基因的Ct值，采用2-Ct法计算各基因的相对表达量。本研究所用大鼠特异性引物序列如下：AMPK：正向TTCGGGAAAGTGAAGGTGGG，反 向GGTTCTGGA TCTCTCTGCGG；Caspase 3：正 向GGAGCTTGGAA CGCGAAGAA，反向ACACAAGCCCATTTCAGGGT；β-actin：正 向GTCGTACCACTGGCATTGTG，反 向CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达 PC12细胞处理后，采用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液收集总蛋白，经浓度测定后取30μg总蛋白在12%SDS-PAGE胶上电泳分离，之后转移至PVDF膜上，经5%小牛血清封闭后分别孵育一抗（p-AMPK：1：2000；AMPK：1：1000；p-TOR：1：1500；TOR：1：2000；p62：1：1000；cleaved caspase 3：1：1000；β-actin：1：1000），4℃过夜；次日洗去未结合一抗后室温孵育相应的HRP-二抗（1：7500）；最后采用ECL化学发光试剂显色，各目的条带的灰度值与内参β-actin灰度值的比值表示其相对表达量。

1.2.7 细胞Caspase-3活性检测 PC12细胞经不同处理后，收集细胞并充分裂解，随后严格按着试剂盒说明书操作，最后使用多功能酶标仪检测细胞内Caspase-3活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计处理，计量资料采用均数±标准差（）表示。两独立样本均数比较采用t检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用S-N-K检测。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NaHS对OGD/R处理神经元细胞mTOR蛋白表达的影响

OGD/R处理明显降低大鼠神经元PC12细胞pmTOR蛋白的表达（P<0.05，图1A～B），而总mTOR蛋白表达未见明显改变（P>0.05，图1C）。而NaHS处理能显著提高OGD/R诱导神经元细胞中p-mTOR蛋白表达（P<0.05，图1D），增加p-mTOR/mTOR的比值（P<0.05，图1）。且NaHS处理能显著降低OGD/R诱导神经元细胞LC3-II与LC3-I比值（P<0.05，图1），提示外源性H2S可激活OGD/R神经元细胞mTOR信号通路，从而抑制OGD/R诱导的自噬。

图1 NaHS对OGD/R大鼠神经元细胞mTOR蛋白表达的影响（n=6）A、E：Western blot条带B：p-mTOR蛋白含量分析图C：mTOR蛋白含量分析图D：p-mTOR与mTOR比值F：LC3-II与LC3-I比值*P<0.05，与Control组相比#P<0.05，与OGD/R组相比Fig.1 The effect of NaHSon the expression of mTORprotein in neurons of OGD/RratsA，E:The image of Western blot；B：Diagram of p-mTOR protein content；C：Diagram of mTOR protein content；D：The ratio of pmTOR and mTOR;F：The ratio of LC3-IIand LC3-I;*P<0.05,vs control group;#P<0.05,vs OGD/Rgroup

2.2 NaHS对OGD/R处理神经元细胞AMPK蛋白表达的影响

Western blot结果显示OGD/R处理大鼠神经元PC12细胞24 h可显著增加胞内p-AMPK蛋白表达（P<0.05），总AMPK蛋白表达未见明显改变（P>0.05）。而NaHS处理可明显降低OGD/R大鼠神经元细胞p-AMPK蛋白的表达（P<0.05），并降低p-AMPK/AMPK的比值（P<0.05，图2）。表明外源性H2S抑制OGD/R神经元细胞AMPK磷酸化。

图2 NaHS对OGD/R大鼠神经元细胞的AMPK蛋白表达的影响（n=6）A：Western blot条带B：p-AMPK蛋白含量分析图C：AMPK蛋白含量分析图；D：p-AMPK与AMPK比值*P<0.05，与Control组相比#P<0.05，与OGD/R组相比Fig.2 The effect of NaHSon the expression of AMPK protein in neurons of OGD/RratsA:The image of Western blot；B：Diagram of p-AMPK protein content；C:Diagram of AMPK protein content；D：The ratio of p-AMPK and AMPK;*P<0.05,vs control group;#P<0.05,vs OGD/Rgroup

2.3 AMPK过表达对NaHS调节OGD/R神经元mTOR蛋白和p62蛋白表达的影响

为阐明AMPK在NaHS减轻OGD/R诱导神经元细胞自噬中的作用，采用AMPK过表达质粒转染细胞。结果显示AMPK过表达质粒显著增加PC12细胞AMPK mRNA和蛋白表达（P<0.01，图3A～C）。与Control组相比，AMPK过表达预处理的大鼠神经元OGD/R处理24 h后p-mTOR蛋白表达显著降低（P<0.05），而p62蛋白的表达增加（P<0.05，图3D～F）。提示外源性H2S通过抑制AMPK、激活mTOR磷酸化，从而降低大鼠神经元细胞自噬。

图3 AMPK过表达对NaHS调节OGD/R神经元细胞的mTOR蛋白和p62蛋白表达的影响（n=3）A：AMPK mRNA表达B～C：AMPK蛋白表达D：Western blot条带E：p-mTOR蛋白含量分析图F：p62蛋白含量分析图G：Western blot条带H：LC3-II与LC3-I比值*P<0.05，与control质粒组相比**P<0.01，与control质粒组相比Fig.3 The effect of AMPK over expression on the expression of p-mTOR and p62 in neurons of OGD/Rrats(n=3)A:The expression of AMPK mRNA；B～C：The expression of AMPK protein；D:The image of Western blot；E:Diagram of p-mTORprotein content；F：Diagram of p62 protein content；G:The image of Western blot；H：The ratio of LC3-IIand LC3-I;*P<0.05,vs control plasmid group;**P<0.01,vs control plasmid group

2.4 AMPK过表达对NaHS处理OGD/R神经元细胞凋亡的影响

与Control组相比，AMPK过表达质粒预处理的大鼠神经元OGD/R后，凋亡相关蛋白Caspase-3 mRNA显著上调（P<0.05），Caspase-3的活化形式cleaved Caspase-3蛋白表达以及Caspase-3活性显著升高（P<0.05）。此外，DNA片断含量明显升高（P<0.05，图4）。表明过表达AMPK可消除NaHS减轻OGD/R诱导的神经元细胞凋亡。

图4 AMPK过表达对NaHS减轻OGD/R诱导PC12细胞凋亡的影响（n=5）A：Caspase-3 mRNA表达B～C：cleaved-Capase-3蛋白表达D：Caspase-3活性检测结果E：DNA片段化结果*P<0.05，与control组相比**P<0.01，与control组相比Fig.4 The effect of AMPK over expression on the apoptosis of PC12 cellsreduced by NaHS(n=5)A:The expression of caspase-3 mRNA；B～C：The expression of caspase-3 protein；D：Result of the activity of caspase-3;E:Result of DNA fragment；*P<0.05,vs control group;**P<0.01,vs control group

3 讨论

脑组织缺血时神经元细胞经历氧糖剥夺，在血流恢复时神经元的氧糖供应也随之得以恢复，但在这个过程中，神经元发生了复杂的分子生物学改变。本研究在前期工作基础上，观察到大鼠神经元经历OGD/R后，胞内AMPK激活，从而抑制mTOR，最终导致自噬活性异常增强，诱导细胞损伤。而外源性H2S预处理，可减轻上述过程，体现出细胞保护效应。因此，本研究从细胞水平上阐述了H2S减轻OGD/R诱导的神经元损伤，丰富了H2S减轻脑卒中的分子机制。

AMPK是一个可表达在全身各器官细胞内，高度保守的能感应能量状态的感受器。当机体发生饥饿和缺氧等时，胞内AMP/ATP比例升高，AMPK则被激活，继而磷酸化下游蛋白以维持稳态。本研究观察到发生脑缺血再灌注时，神经元处于低氧和能量供给不足的状态，AMPK磷酸化水平增高，提示AMPK激活。研究报道心肌细胞发生OGD/R时，AMPK活性也发生改变[12]。但与本研究不同的是，采用激动剂激活AMPK可减轻OGD/R诱导的心肌细胞损伤[12]，这可能与AMPK激活后下游分子事件存在差异有关。近期有研究报道，阻断H2S的内源性生成，可异常激活AMPK，导致OGD/R诱导的神经元发生内质网应激，加重细胞损伤[13]，这进一步证实H2S能够抑制OGD/R时神经元AMPK的异常激活，从而减轻细胞损伤。

自噬在神经元中的作用存在双刃剑的效应。一定程度的自噬具有自我保护作用，例如自噬可清除受损伤的线粒体，维持胞内稳态[14]。然而，过度激活的自噬也参与大脑缺血再灌注损伤。Feng等[15,16]报道柚皮苷通过抑制线粒体自噬而减轻大脑缺血再灌注损伤。此外，右旋美托咪啶通过上调HIF-1α，抑制神经元自噬，从而减轻小鼠脑缺血再灌注损伤[17]。本组前期研究中观察到MCAO诱导的大鼠脑缺血再灌注损伤时，脑组织自噬活性异常增强[6]，而在OGD/R处理的大鼠神经元中mTOR活性下降，提示异常增强的自噬可能是导致神经元损伤的重要机制。本研究也丰富了自噬在神经元缺血再灌注损伤中的作用。

脑组织缺血时神经细胞发生以凋亡为主的神经元死亡，文献显示减轻神经细胞凋亡可以有效降低脑梗死体积[18]。本研究观察到过表达AMPK可消除NaHS减轻OGD/R诱导的神经元细胞凋亡，提示NaHS可能通过激活AMPK减轻OGD/R诱导的神经元细胞凋亡。

H2S在神经系统中的内源性保护作用日益突显。例如，内源性H2S生成障碍可加剧帕金森病小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的神经元的损伤[4]。H2S可以通过降低氧化应激，抑制自噬性的神经元细胞死亡，从而减轻脊髓缺血再灌注损伤[19]。本组前期研究已证实外源性补充H2S可减轻MCAO诱导的大鼠脑缺血再灌注损伤[6]。因此，继续探讨H2S在多种神经系统疾病的代谢改变机制，明确内外源性H2S的保护作用和机制，可尽早实现H2S的临床运用。

综上所述，本实验从细胞水平证实了H2S可通过抑制AMPK活化，进而抑制缺血再灌注时大脑神经元过度的自噬，最终减轻神经元损伤。本实验揭示了H2S减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的分子机制，为H2S的临床运用提供了可靠的实验依据。