活血化瘀解毒方对重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠相关炎症因子、Bax及Bcl-2表达的影响∗

董玉岗 汪 妍 韩 燕

（1.中国人民解放军联勤保障部队第九七〇医院，山东 威海 264200；2.山东省威海市立医院，山东 威海 264200）

重症胰腺炎是临床上常见的急腹症，具有病死率高、并发症多以及预后差等特点。急性肾损伤是重症胰腺炎最主要的并发症之一，亦是患者延长住院时间、增加死亡率的主要原因［1］。炎症介质、细胞因子在重症胰腺炎并发肾损害的病理生理学发病机制中起着重要的作用。目前针对重症胰腺炎合并急性肾损伤尚无特效疗法。随着对重症胰腺炎病理及病机的深入研究，中医药在其治疗方面的疗效逐渐得到循证医学的认可［2］。活血化瘀解毒方是中国人民解放军联勤保障部队第九七〇医院院内协定处方，具有活血化瘀，解毒泻下的功效，在本院应用多年。本研究通过建立重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠模型，探讨活血化瘀解毒方对重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠细胞炎症因子、凋亡基因（Bax）及抑制凋亡基因（Bcl-2）表达的影响，旨在为活血化瘀解毒方治疗急性胰腺炎合并急性肾损伤提供更充分的实验及理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 75只SPF级SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK（京）2018-0019］，雌雄各半，体质量（250±20）g。每笼5只，自由饮水进食，在室温（23±2）℃下，通风良好。

1.2 试药与仪器 1）药物：活血化瘀解毒方（组成：生大黄30 g，板蓝根、白花蛇舌草、水牛角各20 g，赤芍、丹参各15 g，川芎、瓜蒌、甘草各10 g，均为中国人民解放军联勤保障部队第九七〇医院中药房提供，药材加水浸泡30 min，加8倍量水煎煮2次，滤过，分别浓缩成0.25、1 g/mL的煎煮液，放凉后待用），川芎嗪注射液（国药集团容生制药有限公司）。2）试剂：水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），隐血试剂盒、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供，C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-10（IL-10）ELISA试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司，兔抗大鼠Bax多克隆抗体和Bcl-2多克隆抗体均由Santa Cruz公司提供。L-精氨酸和牛磺胆酸钠（美国Sigma公司提供）。3）仪器：仪器：Hll/YF-9光学显微镜（日本Olympus公司产品）；JIDI-20D台式多用途高速离心机（广州吉迪仪器有限公司）；自动酶标仪（美国Bio-Rad公司产品）；7600全自动生化分析仪（日本日立公司产品）。

1.3 分组及造模 1）分组：SPF级雄性SD大鼠，适应性喂养7 d后，进行敞箱实验。将评分相近的75只SD大鼠随机分为5组，每组15只，即假手术组、模型组、阳性组、高剂量实验组和低剂量实验组。2）动物模型制备：参考文献［3］制作重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠模型。将模型组及用药组大鼠水合氯醛麻醉，俯卧固定于手术台，采用血管夹夹闭胆管，24号套管针自十二指肠前壁穿刺进入胰管，以0.1 mL/min逆行性经微量注射泵缓慢匀速注入5%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100g），维持3 min后，见胰腺出现出血、坏死样改变后，退出针头，去除血管夹，关闭腹腔。分3次腹腔内注射1 000mg/100g剂量的20% L-精氨酸溶液，每次间隔1 h。分组分笼饲养，不禁食水。假手术组大鼠仅行腹部手术处理。

1.4 干预方法 造模成功后，假手术组自由饮水进食，模型组灌服纯净水，均尾静脉注射生理盐水10 mL/kg。实验组灌服活血化瘀解毒方，高剂量实验组予200 mg/kg，低剂量实验组予50 mg/kg，尾静脉注射生理盐水10 mL/kg。阳性组以尾静脉注射0.6%川芎嗪注射液10 mL/kg，灌胃10 mL生理盐水。各组均每日给药1次，持续24 h。

1.5 标本采集及检测 1）血清淀粉酶（AMY）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平：抽取各组大鼠的股动脉血5 mL，离心后置于生化管中，用于检测血清AMY、BUN和Cr水平。2）胰腺、肾脏组织病理学观察：取血后，处死大鼠，取胰腺及肾脏组织，置于40 g/L多聚甲醛中固定，HE染色，光镜下取5个视野进行评分。采用改良Crewal法［4］进行胰腺组织病理学评分，Smirh法［5］进行肾脏组织病理学评分。3）炎症因子的测定：收集3 mL心脏血液，离心，分离血清，ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-10及CRP炎症因子水平水平，严格按照试剂盒说明书操作。4）肾脏组织细胞凋亡检测：采用胶原酶消化法分离大鼠肾脏细胞，进行免疫组织化学染色，严格按照试剂盒说明操作。肾脏组织细胞凋亡采用TU⁃NEL法进行检测，以细胞内棕黄色颗粒为阳性细胞，统计阳性细胞数及显色度，采用半定量法进行计数。5）肾组织中Bax蛋白及Bcl-2蛋白表达测定：采血后，剪取3块约1.0 cm3大小的肾实质组织，于-19℃冷冻，逐步解冻后，剪碎肾脏组织匀浆，加入裂解液提取蛋白，4℃条件下，以12 000 r/min离心，取上清液，取20 μg蛋白样品，滴加兔抗BAX或兔抗Bcl-2蛋白，PBS洗涤，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。采用ECL法显色剂显色，以GAPDH为参比，采用BCA法检测Bax和Bcl-2蛋白相对表达水平

2 结 果

2.1 各组胰腺组织病理学表现 见图1。假手术组大鼠的胰腺细胞结构完整，间质内未见水肿、未见炎症细胞浸润。模型组大鼠的胰腺细胞大量死亡，间质内大量炎症细胞浸润并伴有水肿。给予药物干预后，低剂量实验组大鼠的胰腺细胞间质内炎症细胞浸润明显并伴有大量水肿，胰腺细胞死亡明显减少；阳性组和高剂量实验组大鼠的胰腺细胞间质少量炎症细胞浸润伴有少量水肿及少量胰腺细胞坏死。

图1 各组大鼠胰腺组织病理观察（HE染色，200倍）

2.2 各组肾脏组织病理学表现 见图2。假手术组大鼠的肾脏组织细胞无见明显病理学改变。模型组大鼠的肾间质瘀血、炎症细胞浸润，肾小球退行性变，肾小管管腔明显狭窄并伴有水肿、坏死。给予药物干预后，低剂量实验组大鼠的肾小管上皮细胞间质内炎症细胞浸润明显并伴有大量水肿，死亡明显减少；阳性组和高剂量实验组大鼠的肾小管上皮间质少量炎症细胞浸润伴有轻度水肿及少量细胞坏死。

图2 各组大鼠肾脏组织病理观察（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理学评分以及肾脏病理学评分比较 见表1。与假手术组比较，模型组大鼠的血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理学评分以及肾脏病理学评分明显升高（P<0.05）。给予药物干预后，阳性组和实验组大鼠的血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理学评分以及肾脏病理学评分明显降低（P<0.05），低剂量实验组大鼠的血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理学评分以及肾脏病理学评分明显高于阳性组和高剂量实验组（P<0.05），而阳性组和高剂量实验组间比较无明显差异（P>0.05）。

表1 各组大鼠AMY、BUN、Cr水平及胰腺病理学评分、肾脏病理学评分比较（±s）

表1 各组大鼠AMY、BUN、Cr水平及胰腺病理学评分、肾脏病理学评分比较（±s）

与假手术组比较，∗P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与低剂量实验组比较，▲P<0.05。下同

组别假手术组模型组阳性组低剂量实验组高剂量实验组n 15 15 15 15 15 AMY（IU/L）1 125.00±20.50 3 245.37±244.38*2 132.03±155.01*△▲2 839.24±264.14*△1 963.95±213.96*△▲Cr（μmol/L）38.12±2.87 75.28±4.26*42.98±3.42*△▲58.85±3.67*△43.15±4.05*△▲BUN（mmol/L）7.06±1.47 23.24±3.36*9.37±3.59*△▲15.64±4.12*△9.68±3.87*△▲胰腺病理学评分0.44±0.19 11.23±0.32*3.12±0.24*△▲5.43±0.62*△3.71±0.32*△▲肾脏病理学评分0.61±0.17 7.47±0.36*0.97±0.25*△▲1.85±0.16*△1.07±0.24*△▲

2.4 各组大鼠炎症因子水平比较 见表2。与假手术组比较，模型组大鼠的TNF-α、IL-10、CRP以及 IL-6水平明显升高（P<0.05）。给予药物干预后，与模型组比较，阳性组和实验组大鼠的炎症因子水平明显降低（P<0.05），低剂量实验组大鼠的炎症因子明显高于阳性组和高剂量实验组（P<0.05），而阳性组和高剂量实验组间比较无明显差异（P>0.05）。

表2 各组大鼠炎症因子水平比较（±s）

表2 各组大鼠炎症因子水平比较（±s）

组别假手术组模型组阳性组低剂量实验组高剂量实验组n 15 15 15 15 15 TNF-α（μg/mL）39.73±6.09 65.57±7.24*41.98±7.05*△▲43.27±5.94*△42.35±7.23*△▲CRP（mg/mL）4.53±0.67 7.52±0.85*4.76±0.54*△▲4.95±0.46*△4.82±0.71*△▲IL-10（pg/mL）15.14±4.59 86.23±13.12*24.12±11.74*△▲35.43±10.62*△25.47±5.26*△▲IL-6（pg/mL）21.12±2.67 99.47±13.86*43.76±8.45*△▲55..89±9.56*△44.07±8.09*△▲

2.5 各组大鼠肾脏组织细胞凋亡指数比较 见表3。与假手术组比较，模型组大鼠各时间点凋亡指数均明显高于假手术组（P<0.05）。给予药物干预后，与模型组比较，阳性组和实验组大鼠各时间点凋亡指数明显降于模型组（P<0.05），且随时间延长而增加，低剂量实验组大鼠各时间点凋亡指数明显明显高于阳性组和高剂量实验组（P<0.05），而阳性组和高剂量实验组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组大鼠肾脏组织细胞凋亡指数比较（±s）

表3 各组大鼠肾脏组织细胞凋亡指数比较（±s）

组别假手术组模型组阳性组低剂量实验组高剂量实验组n 15 15 15 15 15 6 h 1.21±0.42 9.37±0.38*4.03±0.91*△▲5.24±4.14*△4.15±3.96*△▲12 h 1.25±0.27 12.28±0.76*5.98±1.02*△▲7.85±3.67*△6.15±1.05*△▲24 h 1.32±0.47 15.24±0.66*7.37±1.59*△▲9.64±4.12*△7.68±1.17*△▲

2.6 各组大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较 见表4。假手术组大鼠的Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达较弱。模型组大鼠的Bax蛋白表达明显增强，以肾小管区为主，且随着时间延长逐渐增高；Bcl-2蛋白表达明显降低。给予药物干预后，各用药组Bax基因表达下调，各时间点Bax表达值较同时间模型组明显降低（P<0.05），仍高于假手术组，Bax水平随着时间延长而逐渐增高的趋势，阳性组和高剂量实验组的Bax蛋白表达明显低于低剂量实验组（P<0.05）。各用药组各时间点Bcl-2蛋白表达值较同时间模型组明显升高，阳性组和高剂量实验组的Bcl-2蛋白表达明显高于低剂量实验组（P<0.05），阳性组和高剂量实验组间的Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达比较无显著差异（P>0.05）。

表4 各组大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较（±s）

Bax Bcl-2组别n假手术组模型组阳性组低剂量实验组高剂量实验组15 15 15 15 15 6 h 1.24±0.34 5.21±0.49*3.96±0.35*△▲4.47±0.61*△4.13±0.57*△▲12 h 1.27±0.57 7.23±0.84*5.13±0.78*△▲6.32±0.62*△5.65±0.81*△▲24 h 1.33±0.49 8.57±0.64*5.39±0.75*△▲6.87±0.94*△5.74±0.59*△▲6 h 1.22±0.14*0.71±0.13*0.81±0.16*△▲0.77±0.17*△0.80±0.41*△▲12 h 1.24±0.31*0.81±0.10*0.94±0.14*△▲0.87±0.15*△0.92±0.11*△▲24 h 1.31±0.27*0.78±0.09*1.15±0.12*△▲0.96±0.09*△1.10±0.14*△▲

3 讨 论

重症胰腺炎是由胰腺的局部炎症快速发展形成的全身炎性反应，其死亡率高，并发其他重要脏器功能衰竭［4］。重症胰腺炎合并肾损伤是多因素参与的复杂的病理过程，细胞凋亡参与了重症胰腺炎时急性肾损伤的发生发展，炎症因子的高度表达是其发生的主要机制［5］。炎症因子进入肾脏血液循环使血流动力学发生紊乱，持续性缺血低灌注血，进而引发肾损伤。血清TNF-α、IL-6和IL-10作为重症胰腺炎时大量释放的炎症因子，导致全身性炎症反应，并可刺激CRP合成，激发过度免疫反应，导致肾脏功能障碍。研究发现［6］，Bax及Bcl-2蛋白参与重症胰腺炎大鼠的肾脏组织损伤过程。Bax是线粒体途径重要的促凋亡因子，可诱导细胞凋亡；Bcl-2为高度同源蛋白中的经典的抗凋亡蛋白，不仅调节细胞凋亡而且在调控细胞自噬的过程中也有重要作用［7］。此外，Bcl-2还能调控氧化应激诱导自噬和凋亡［8］。Bax拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用同时，还可促进细胞凋亡。Bcl-2可竞争性地与Bax结合，中和Bax诱导凋亡的作用，减少细胞凋亡。

重症胰腺炎属于中医学“胃脘痛”“脾热病”和“结胸病”的范畴。中医认为其治则应清热燥湿、泄热毒、下瘀血、行积滞以及疏肝理气。活血化瘀解毒方是院内协定处方，具有清热解毒、泻下、活血化瘀的功效。方中重用生大黄荡涤肠胃、峻下实热、解毒祛瘀。配以板蓝根、白花蛇舌草和水牛角增加清热解毒之效，赤芍、丹参、川芎清热活血化瘀，瓜蒌清热化痰、宽胸散结，甘草调和诸药。现代药理学研究发现，大黄中游离蒽醌类化合物可抑制局部炎症反应，阻断多器官功能障碍的发生［9］，减低病理学评分［10］。丹参酮ⅡA对急性胰腺炎大鼠明显改善药理学症状，减轻炎性细胞浸润［11］。近年研究发现［12］，肠源性内毒素血症导致重症胰腺炎继发感染，川芎嗪可清除氧自由基，调节细胞凋亡，降低炎症递质的释放，增加脏器微循环血流量，已广泛用于临床各种疾病的治疗［13-16］。

本研究结果显示，给予药物干预后，阳性组和实验组大鼠的AMY、Cr、BUN、胰腺病理学评分、肾脏病理学评分以及炎症因子水平明显降低。提示活血化瘀解毒方能有效改善重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠的血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、胰腺病理学评分以及肾脏病理学评分，低剂量实验组大鼠的TNF-α、IL-10、CRP以及IL-6水平明显高于阳性组和高剂量实验组（P<0.05），阳性组和高剂量实验组间比较无显著差异（P>0.05）。提示活血化瘀解毒方能有效降低重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠炎症因子水平。给予药物干预后，与模型组比较，阳性组和试验组大鼠的炎症因子水平明显降低（P<0.05），Bax蛋白表达明显下调，Bcl-2蛋白表达明显上调，低剂量实验组大鼠的炎症因子和Bcl-2蛋白表达明显高于阳性组和高剂量实验组，Bax蛋白表达明显低于阳性组和高剂量实验组，而阳性组和高剂量实验组间比较无显著差异（P>0.05）。提示活血化瘀解毒方能有效降低重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠肾脏组织细胞凋亡，下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达。

综上所述，活血化瘀解毒方可有效降低重症胰腺炎合并急性肾损伤大鼠相关炎症因子水平、AMY、Cr、BUN水平，减少肾脏阻止细胞凋亡，改善胰腺以及肾脏病理学、Bax及Bcl-2蛋白表达。