平喘颗粒对哮喘大鼠气道重塑及TGF-β1/Smads信号通路的影响∗

李 星 李竹英 王丽洁△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种炎症细胞及细胞组分相互作用的慢性气道异质性疾病，发病过程中受到炎性介质的不断刺激而触发气道壁损伤和气道结构变化，从而导致气道重塑。因此，延缓气道重塑的进展已经成为目前防治哮喘的一个重要方向。平喘颗粒是国家级名老中医刘建秋教授传承前辈思想并结合多年临床实践经验所创立，刘教授认为哮喘慢性持续期的病机根本为“阳虚痰盛”，故以“温阳益气，化痰平喘”为核心思想组方平喘颗粒用于哮喘慢性持续期的临床治疗。前期研究发现［1-3］，平喘颗粒可以通过抑制上皮间质转化和血管生成、干预上皮细胞自噬与凋亡改善哮喘气道重塑。TGF-β1/Smads信号通路与哮喘关系密切，可通过调节多种相关蛋白和细胞因子，影响气道平滑肌的增殖和胶原沉积等方式参与气道重塑的发生发展［4-5］。本研究通过观察平喘颗粒对哮喘大鼠TGF-β 1/Smads信号通路的影响，探讨平喘颗粒在改善气道重塑方面更广泛的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠40只，体质量（180±20）g，许可证号：SCXK（吉）-2011-0007，购于延边大学。

1.2 实验药物 平喘颗粒，组成：淫羊藿200 g，太子参150 g，黄芪 150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黄100 g，款冬花（炙）150 g，地龙100 g，罂粟壳40 g。药材加水煎煮2次，每2小时过滤1次，醇沉浓缩成相对密度为1.20～1.25（60 ℃）的稠膏［6］，加入蔗糖、糊精适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成1 000 g（由黑龙江中医药大学附属第一医院制备，批号：20180723）。按前期研究的最佳质量浓度（1.08 g/mL）含药溶液灌胃，根据人体与动物的每千克体质量折算系数计算，给药剂量为5 mL/kg。

1.3 试剂与仪器 卵蛋白（OVA）（上海生工生物技术有限公司，A003056-0100）；Masson染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，BP-DL021）；Anti-TGF beta 1 antibody［EPR21143］（英国 abcam，ab215715）；Smad2/3（D7G7）XP® Rabbit mAb（美国CST，8685S）；内参抗体β-actin（santa cruz，sc-47778）；PVDF膜（上海谷研生物技术有限公司，GOY-C3192）；PMSF（北京伊塔生物技术有限公司，YT1705）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（英国abcam，ab102536）；Western及IP细胞裂解液（上海梵态生物技术有限公司，FT-LG1227）。RM2235石蜡切片机，德国Leica；Lx81研究级倒置荧光显微镜，日本Olymps公司；-30℃恒冷低温切片机CM69001，德国Leica；OLABO水平摇床，济南欧莱博科学仪器有限公司；165-8001型电泳仪，美国Bio-Rad；DYCZ-40D转移槽，北京六一仪器厂。

1.4 分组与造模 将40只Wistar大鼠随机分为空白对照组、哮喘组、平喘颗粒组，地塞米松组，每组10只。根据文献［7］方法，应用OVA致敏液［10 mg OVA+100 mg Al（OH）3］制备慢性哮喘大鼠模型，腹腔注射10% OVA致敏液1 mL（分别于第0、12天），之后每天改用5% OVA致敏液激发30 min，持续5 d，然后隔1 d激发1次，持续6周。空白对照组给予生理盐水代替OVA激发。

1.5 给药方法 平喘颗粒组：给予5mL/kg平喘颗粒药液灌胃，于第2次致敏后第4天开始进行，激发阶段则每次激发前1 h给药。地塞米松组：给予0.45 mg/kg地塞米松药液灌胃，给药时间同平喘颗粒组。空白对照组、哮喘组给予5 mL/kg的生理盐水灌胃，时间同平喘颗粒组。

1.6 标本采集与检测 各组大鼠末次激发24 h后处死，开胸取固定的肺组织行石蜡包埋、切片，采用Masson染色，光镜下观察肺组织的病理学改变。采用计算机图像分析系统（Image-Pro Plus Version 6.0）分析病理图像，测定支气管基底膜周径（Pbm）、气道平滑肌面积（WAm）、支气管内壁面积（WAi），并以 Pbm 对各项面积指标进行标准化，以此反映气道病理变化。

1.7 Western blotting检测 各组取-70℃冻存的大鼠右肺前叶及中叶部分组织，切成非常细小的碎片，经蛋白质抽提、裂解、离心，提取大鼠肺组织总蛋白，进行蛋白质定量，按BCA蛋白试剂盒说明操作以检测蛋白浓度，酶标仪570 nm波长滤光片进行读数，记录数据。然后凝胶电泳、转膜后进行封闭及抗体孵育，孵育二抗后继续洗涤、显色，最后用Gel-Pro-Analyzer软件对目标条带进行灰度分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理观察结果 见图1。空白对照组大鼠支气管管腔光滑，气管壁及平滑肌无增厚。哮喘组大鼠气道管腔明显变窄，气管壁和气道平滑肌厚度增加，气道周围可见较多的蓝色胶原纤维组织。平喘颗粒组上述病理结构改变明显减轻，但与正常组仍有差距，气道周围的蓝色胶原纤维组织减少。地塞米松组上述病理结构改变和胶原沉积均明显减轻。

图1 各组大鼠肺组织病理观察（Masson染色，200倍）

2.2 各组大鼠WAm/Pbm、WAi/Pbm比较 见表1。与空白对照组比较，哮喘组大鼠气道平滑肌厚度、气管内壁厚度明显增加（P<0.05）。给予平喘颗粒和地塞米松治疗后大鼠气道平滑肌厚度、气管内壁厚度明显降低（P<0.05），平喘颗粒组和地塞米松组WAm/Pbm、WAi/Pbm比较无显著差异（P>0.05）。

表1 各组大鼠WAm/Pbm、WAi/Pbm比较（μm2/μm±s）

表1 各组大鼠WAm/Pbm、WAi/Pbm比较（μm2/μm±s）

注：与空白对照组比较，∗P<0.05；与哮喘组比较，★P<0.05。下同。

组别空白对照组哮喘组平喘颗粒组地塞米松组n 10 10 10 10 WAm/Pbm 7.77±0.31 17.22±0.59*9.28±0.39*★9.15±1.06*★WAi/Pbm 27.16±1.50 42.04±3.29*31.05±1.23*★30.59±1.56*★

2.3 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3表达的比较 见图2、表2。与空白对照组比较，哮喘组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3的表达水平明显增高（P<0.05）。给予平喘颗粒和地塞米松治疗后，大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3的表达水平明显降低（P<0.05），平喘颗粒组和地塞米松组TGF-β 1、Smad2和Smad3的表达水平比较无显著差异（P>0.05）。

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2和Smad3表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2和Smad3表达水平比较（±s）

组别空白对照组哮喘组平喘颗粒组地塞米松组n 10 10 10 10 TGF-β1 0.072±0.002 0.728±0.003*0.102±0.005*★0.099±0.006*★Smad2 0.080±0.004 0.665±0.003*0.283±0.006*★0.279±0.009*★Smad3 0.075±0.005 0.560±0.004*0.212±0.007*★0.208±0.002*★

图2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达

3 讨 论

气道重塑是由于气道内慢性炎症病变持续刺激致气道损伤与组织增生而造成的气道结构异常改变，不仅导致患者呼吸困难，日久会严重损伤肺功能，成为哮喘难以根治的主要原因［8-9］。TGF-β1被认为是气道重塑的重要中介［10-11］，通过促进气道纤维化和平滑肌增生肥大、诱导上皮-间质转化（EMT）、积聚胶原产生和细胞外基质（ECM）等形式发挥作用［12-14］。哮喘发病时，肺和气道内多种炎性细胞可以释放出大量的TGF-β1，TGF-β1介导下游的Smad蛋白发生磷酸化，通过自分泌和旁分泌途径激活Smad2/3通路，Smad2、Smad3磷酸化后促进α-SMA的表达，加重气道重塑［15］。研究显示，抑制Smad3磷酸化可以延缓上皮细胞EMT过程，调控ECM动态平衡，从而改善气道重塑［16］。

平喘颗粒是黑龙江中医药大学附属第一医院自制的中药制剂，全方由9味中药组成。方中麻黄温通宣肺平喘，淫羊藿入肾经振奋阳气，二者为君，阳气通达，肺脏宣散之气得以肃降，肾脏气化功能得以恢复。五味子入肺肾二经，敛肺止咳。太子参补脾肺气阴兼化痰止咳，黄芪补脾升阳，二者一阴一阳，相须为用。款冬花宣肺止咳，地龙泻热平喘，以上5味共为臣药。罂粟壳酸涩收敛，可敛肺气以止咳，同时防止君药辛散耗气，为佐药。知母甘寒养阴，润肺止咳，可降肺之气逆，引诸药归经，为使药。方中药物配伍升降有序，阴阳同补，收散并用，补益脏气、温化痰湿、宣畅气机，共奏温阳益气，化痰平喘之功。研究显示，平喘颗粒中的多种化学成分如淫羊藿苷、麻黄碱、黄芪多糖、黄芪甲苷、款冬花总倍半萜等均可以起到改善哮喘气道重塑的作用［17-21］。

本实验中应用OVA致敏液制备慢性哮喘大鼠模型，哮喘组大鼠可见气道管腔变窄，气管壁和气道平滑肌厚度增加，气道周围较多的蓝色胶原纤维组织等病理改变，WAm/Pbm、WAi/Pbm均明显增高，表明哮喘模型制备成功，哮喘组大鼠存在气道重塑。研究结果显示，与哮喘组相比，平喘颗粒组和地塞米松组大鼠气道病理结构改变和胶原沉积均明显减轻，WAm/Pbm、WAi/Pbm明显下降（P<0.05），且肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3的表达水平明显下降（P<0.05）。综上所述，平喘颗粒可以减轻哮喘大鼠气道重塑的病理改变，其机制可能与调控TGF-β1/Smads信号通路有关。哮喘是一种包含多种病理因素的复杂疾病，本文虽然探讨了平喘颗粒在气道重塑方面的相关机制，但在哮喘作用机制方面仍有许多值得研究的领域，如气道炎症、气道高反应性、免疫应答、氧化应激等，这些重要的作用机制以及平喘颗粒与其的关系还需要在未来更加深入的探索。