几种外源物质对盐胁迫下火力楠幼苗生理特性的影响1)

粟莉圆 胡颖 梁机 杨章旗 陈旋 孙明升

(广西大学，南宁，530004)(广西壮族自治区林业科学研究院)

盐胁迫不仅会导致植物渗透胁迫，根系吸水困难，造成水分及营养的供应不足；同时体内积累活性氧，若不能及时清除会对叶绿素、不饱和脂、蛋白质、核酸等生物分子具有破坏作用[1]，进而引起酶活性下降、蛋白降解和脂质过氧化等反应[2]。甜菜碱(BT)具有调节植物对环境胁迫的适应性，提高细胞渗透调节的能力，可减少渗透失水对植物造成的伤害[3]。它具有保持细胞与外界环境渗透平衡的稳定复合蛋白4级结构，使受到盐胁迫影响而降低的Rubisco恢复活力，保持相关酶处于有功能的状态[4]；有研究表明在盐胁迫下添加外源甜菜碱后，明显提高了玉米及小麦的光合能力、气孔导度、蒸腾速率和相关抗氧化酶的活性，从而抵御盐胁迫环境[5]。钙(Ca2+)是植物生长发育所必须的元素，与维持细胞膜通透性、离子运输、信号转导等过程息息相关[6]，可增加植物抗性，尤其是产生抗盐性状。盐胁迫下，细胞游离Ca2+浓度的增加显著减少了细胞内Na+的浓度。有证据表明，Ca2+是通过降低质膜透性来减少Na+进入细胞的。当植物受到盐胁迫时，细胞内的Ca2+浓度增加，Ca2+通过与其主要受体CaM结合，从而进一步激活适当的蛋白激酶，激发细胞产生应激反应，这是Ca2+的一般作用方式[4]。丁能飞等[7]发现外源钙的添加可显著促进西兰花的生长、增加鲜重，使SOD、POD、CAT活性升高，降低西兰花叶片MDA含量，减轻盐胁迫对叶片膜脂过氧化程度，减少地上部、地下部Na+的积累，增加K+、Ca2+的浓度，提高其耐盐性。茉莉酸(MeJA)参与调控植物发育、渗透胁迫和防御反应过程等[8]。有研究表明外源施用茉莉酸甲酯能有效对抗盐胁迫造成的生长抑制，减轻盐胁迫对幼苗造成的伤害，提高幼苗的耐盐能力[9]。研究还发现，MeJA不仅可系统诱导蛋白酶抑制剂(PI)和多酚氧化酶(PPO)，从而影响植物对营养物质的吸收，还能增加过氧化物酶和脂氧合酶等防御蛋白的活性水平，使植物积累生物碱和酚酸类次生物质增加并改变挥发性信号化合物的释放[10]。Taheri et al.[11]报道了盐胁迫诱导牛舌草叶片鲜质量、叶面积、叶相对含水量(RWC)、叶绿素a、可溶性糖、总蛋白质等含量显著降低，而MeJA缓解了盐胁迫植株的不良作用。水杨酸(SA)对植物的作用主要在防病害及缓解逆境胁迫方面，作为信号分子来调控植物基因表达而影响其生理特性，提高植物抗性[12]。在Mimouni et al.[13]的研究中，NaCl胁迫下大针茅幼苗的相对电导率和MDA质量分数提高，而净光合作用、相对含水量降低，幼苗整体的生长速率明显降低。对叶片施用SA能提高叶绿素质量分数和抗氧化酶活性，并增加CO2的净同化速率，提高光合作用过程，减轻膜损伤，进而增加了茎和根的干物质含量。还有研究发现幼苗的发芽率和生长速率(从茎和根的长度来看)在盐处理下显著降低，通过添加SA可以调节缓解盐胁迫对水稻植株的不利影响[14]；外施不同浓度的水杨酸后，白刺叶片质膜所受伤害均有不同程度的缓解[15]。目前，国内外对植物耐盐生理机制、外源物质添加对植物生理的影响做了许多研究，外源添加上述4类物质已被证明可有效缓解盐胁迫对植物的伤害；但同时使用两种以上外源物质及其不同浓度处理探究植物盐胁迫生理特性的报道较少，此外研究对象多为农作物等草本植物，在用材林树种火力楠耐盐性方面也未涉及。

广西滨海地区土壤作为后备资源用地，具有优良的立地条件，但造林树种单一，生物多样性低[16]，丰富沿海造林树种，对广西林业发展以及生态可持续具有重要的意义。但沿海地区土壤含盐量高，过量的盐会影响植物种子萌发、生长发育和光合作用，最终对植物产生毒害作用。火力楠(MicheliamacclureiDandy)学名醉香含笑，为木兰科含笑属乔木，是华南地区珍贵速生常绿阔叶树种之一，具有很高的经济价值。其木材可做优良建筑和家具用材，果实可提取植物油。本文研究4种外源物质对盐胁迫下火力楠幼苗生理指标的影响，探究外源物质处理对盐胁迫下火力楠幼苗的生理代谢机制，筛选出缓解盐胁迫的最佳外源物质种类及其浓度或物质的量，旨在为广西沿海造林绿化与生态工程建设提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验苗木处理在广西大学林学院苗圃进行，供试1年生火力楠幼苗来源于广西林科院。2018年7月选取长势一致、健康良好，苗高55～65 cm的1年生火力楠盆栽幼苗用于试验。

1.2 试验设计

盐胁迫前对幼苗采用BT、CaCl2、MeJA、SA 4种外源物质进行喷施处理，每种外源物质分别设置低、中、高3种质量浓度或浓度梯度(表1)。一个组包含30～40株幼苗，总共12组，另设对照。每天上午08：00对火力楠幼苗喷施上述溶液，喷施量以叶片正反面完全湿润到刚有水滴出为准，连续喷施3 d，而后使用300 mmol·L-1NaCl溶液浸没至营养杯2/3处，处理7 d。以未作任何处理的普通幼苗为对照CK1，以单盐胁迫处理幼苗为对照CK2，分别在NaCl处理第1天、第4天和第7天早上08：00测定叶绿素质量分数，并采集幼苗根茎向上第4～5位火力楠叶片带回实验室保存在超低温冰箱-80 ℃，进行其余各项指标测定，重复3次。

表1 不同处理组合梯度设置

1.3 指标测定

采用相对电导率法[17]测量细胞膜透性；叶绿素质量分数采用SPAD502叶绿素含量测定仪测定。可溶性糖质量分数(SS)、可溶性蛋白质量分数(SP)、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性分别根据苏州科铭生物技术有限公司试剂盒说明书进行测定。

1.4 数据分析

试验数据用Excel 2010进行收集与整理，检验方法使用双因素重复测量方差分析，运用SPSS 24进行一般描述与统计并进行事后多重比较(LSD法)，P<0.05为显著差异，Oringin 2017作图；Fuzzy综合评价法评价不同处理下火力楠幼苗的耐盐性，具体计算方法如下：

2 结果与分析

2.1 外源物质处理对盐胁迫下叶片相对电导率的影响

由表2可知，随着盐胁迫时间的增加各处理的相对电导率逐渐升高，CK2处理叶片在NaCl胁迫后的相对电导率均显著高于CK1(P<0.05)，说明叶片细胞膜受损，膜透性逐渐增大。喷施外源物质后，各处理的相对电导率均显著低于单盐胁迫CK2，4种外源物质的中等质量浓度或浓度处理下相对电导率较低，其中S2、C2、MJ2处理的相对电导率分别为CK2的71.93%、73.68%、75.44%。以上分析表明这4种外源物质中等质量浓度或浓度处理可显著缓解叶片盐害，其中SA中质量浓度处理(S2，100 mg·L-1SA)相对电导率最小，缓解盐伤害效果最好。

表2 盐胁迫下外源物质处理叶片相对电导率的变化

2.2 外源物质处理对盐胁迫下叶片叶绿素质量分数的影响

从表3可以看出，随着盐胁迫时间的增加，各处理叶绿素质量分数呈下降趋势。胁迫7 d后，大部分处理叶绿素的质量分数均高于对照CK2，但差异均未达到显著水平，比CK2高出0.02～0.21 mg·g-1。由此可见，火力楠幼苗叶绿素质量分数在短时间盐胁迫下响应不灵敏，在外源物质作用下略有提高。

表3 盐胁迫下外源物质处理火力楠幼苗叶绿素质量分数变化

2.3 外源物质处理对盐胁迫下叶片可溶性蛋白和可溶性糖的影响

表4显示，随着盐胁迫时间的增加，单盐处理CK2的可溶性糖质量分数逐渐升高，在7 d后为CK1的1.21倍，在4种外源物质作用下可溶性糖质量分数较CK2均有提高，且存在显著差异(P<0.05)。4种外源物质处理调节可溶性糖质量分数升高作用大小排序为MeJA、BT、SA、CaCl2；外源物质MeJA高物质的量、BT高浓度以及CaCl2低物质的量处理下可溶性糖质量分数显著高于CK2，其中可溶性糖质量分数最高的MJ3(3 mmol·L-1)比CK2高出2.28 mg·g-1。

表4 盐胁迫下外源物质处理叶片可溶性糖质量分数变化

从表5可以看出，喷施不同4种外源物质在盐胁迫后可溶性蛋白质量分数均高于CK2(P<0.05)，且由大到小MeJA、SA、BT、CaCl2。其中MeJA、BT处理与CK2存在显著差异；但其不同浓度或物质的量处理间不存在明显差异。测定结果表明，盐胁迫下火力楠幼苗渗透调节功能受到了影响，4类外源物质均可调节火力楠幼苗的渗透能力，减轻幼苗受到的伤害，综合比较发现外源MeJA处理可显著调节叶片中可溶性糖和蛋白质的质量分数，其次SA、BT处理效果也相对较好。

表5 盐胁迫下外源物质处理叶片可溶性蛋白质量分数的变化

2.4 外源物质处理对盐胁迫下叶片CAT、POD、SOD活性的影响

由表6可知，在整个盐胁迫过程中CK2活性都高于CK1，在4d后达到显著差异(P<0.05),说明盐胁迫刺激火力楠幼苗CAT活性升高；不同外源物质处理后，除B1、C2外各处理CAT活性总体呈升高趋势。MeJA作用相比其他3种外源物质使幼苗CAT活性升高更明显，MeJA高物质的量处理(MJ3)后叶片CAT活性为CK2的1.51倍。

表6 盐胁迫下外源物质处理叶片CAT活性变化

盐胁迫后，CK2的POD活性先升高后下降，四种外源物质均能提高叶片POD活性(表7，P<0.05)，作用大小排序为MeJA、CaCl2、SA、BT，其中MeJA、CaCl2这两种外源物质与对照存在明显差异；4种外源物质的低质量浓度或浓度处理后叶片POD活性均显著高于对照。POD活性最高为S1(25 mg·L-1SA)处理后的火力楠叶片，最低为S3(200 mg·L-1SA)处理，说明POD活对SA浓度变化响应灵敏。

表7 盐胁迫下外源物质处理叶片POD活性变化

从表8可以看出，整个盐胁迫过程中单盐处理(CK2)的SOD活性均高于CK1，随着胁迫时间的增加呈升高趋势，4种外源物质处理后SOD活性均显著提高(P<0.05)；外源物质CaCl2低、中浓度以及SA中、高质量浓度作用相较其他处理的SOD活性升高显著。综上可得，除MJ2外，各处理均能显著增加火力楠幼苗叶片中的SOD活性，其中S2(100 mg·L-1SA)处理下叶片SOD活性升高明显。

2.5 盐胁迫下火力楠幼苗生理指标的相关分析

由表9可得，盐胁迫下火力楠叶片相对电导率(RC)与可溶性糖质量分数、SOD活性呈极显著正相关(P<0.01)；叶绿素质量分数与可溶性糖质量分数呈显著负相关(P<0.05)；可溶性蛋白质量分数与CAT活性呈显著正相关(P<0.05)，与SOD活性呈极显著正相关(P<0.01)。相关分析结果表明当幼苗受到盐胁迫导致叶片受到伤害，细胞液外渗、相对电导率升高，活性氧等氧化物自由基对细胞膜系统的损害加重，细胞内渗透调节物质如可溶性糖、可溶性蛋白质量分数及CAT、SOD酶活性也升高，而叶绿素质量分数受到盐胁迫影响而降低。

表9 盐胁迫下火力楠幼苗各生理指标间的相关分析

2.6 外源物质处理下火力楠幼苗耐盐胁迫的综合评价

采用Fuzzy综合评价法计算各处理指标的隶属值及对总分排序(表10)，总分越高表示参试处理越能降低火力楠幼苗所受盐害。4类外源物质缓解效果排序由大到小为MeJA、SA、CaCl2、BT，其不同质量浓度或浓度处理排序由大到小分别为B1、B3、B2，C1、C3、C2，MJ3、MJ1、MJ2，S2、S3、S1。排名大于CK1的处理从高到低为MJ3、S2、C1、MJ1、S3、MJ2、S1、C3、B1、B3、C2。说明对叶片喷施3 mmol·L-1MeJA(MJ3)最能有效提高火力楠幼苗的耐盐能力。

表10 盐胁迫下外源物质处理火力楠幼苗生理指标的隶属值及排序

3 结论与讨论

对多数植物来讲，盐含量过高会影响植物生长发育和生理功能，改变植物体内的渗透平衡，降低光合作用，使植物生长变慢甚至死亡[18]。研究表明，逆境胁迫下细胞膜相对透性明显变化，大量细胞内物质外渗，组织浸泡液的电导率会升高，同时还引起生理代谢紊乱，酶系统受影响，叶绿体结构遭破坏，光合作用变弱等[19]。本研究在300 mmol·L-1NaCl胁迫下，火力楠幼苗的相对电导率随着胁迫时间的增加显著升高，与前人研究结果相一致[18]。喷施中等质量浓度或浓度的BT、CaCl2、MeJA、SA后的火力楠幼苗均可提高其耐盐能力，其中100 mg·L-1SA处理效果好。可能由于在胁迫中SA是驱动植物防御基因的表达的信号因子，能诱导特异基因表达，合成与植物细胞防御有关的蛋白质及次生物质[20]。间接使这些次生物质作用于火力楠幼苗渗透，使这两类外源物质处理后的电导率更低，变幅更小。本试验结果还说明了4种外源物质过低或过高浓度处理下对火力楠幼苗的相对电导率影响较小甚至会加重幼苗受到的盐害。

叶绿素质量分数影响植物光合作用强弱，是衡量植物代谢的重要指标，盐胁迫下叶片中叶绿素质量分数会降低[21]，Rao等认为叶绿素的减少主要由于叶绿素酶对叶绿素b的降解所致[22]。本试验中喷施外源物质后300 mmol·L-1NaCl处理下火力楠幼苗体内叶绿素质量分数各处理随着盐胁迫时间的增加呈下降趋势，但差异不显著，可能是盐胁迫时间短而对叶绿素影响作用较小导致。

可溶性糖和可溶性蛋白是植物体内重要的渗透调节物质，为适应逆境条件，可主动积累[23]。本试验中在外源物质作用下可溶性糖和蛋白质大量合成，调节细胞渗透功能以维持细胞稳态，这与宿越[24]等的结果一致。其中3 mmol·L-1MeJA处理对叶片中可溶性糖和蛋白质质量分数增加效果最佳。

植物抗氧化防御系统由抗氧化酶活性和非酶抗氧化水平组成。大量研究表明，在盐胁迫下，大多数植株中编码抗氧化酶的基因(如SOD、POD和CAT)表达上调，如豌豆、北美豆梨等[25-26]；也有研究发现盐胁迫下植物SOD、POD和CAT活性先上升后下降[27]。山思雨[28]等发现盐胁迫下外源MeJA处理颠茄叶片的抗氧化酶活性均高于单盐处理；MeJA对盐胁迫下沙冬青幼苗也有同样的作用[29]。本研究中在盐胁迫下火力楠叶片的CAT、SOD活性均升高，POD活性先升高后下降，在施用外源MeJA后CAT活性变强，SA处理下POD、SOD活性明显升高。盐胁迫下3种抗氧化对盐胁迫的作用机制不同导致酶活性表达有差异。CAT负责清除由光呼吸或脂肪酸氧化过程中形成的过氧化物；POD则主要催化H2O2、氧化酚类和胺类化合物；SOD是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶[30]。SA可通过调控信号分子代谢酶的活性而积累H2O2，H2O2作为第二信使诱导保护酶的合成[31]，这可能是SA相比其他3种外源物质对酶活性影响更显著的原因。

综上，适宜浓度或物质的量的外源甜菜碱、氯化钙、水杨酸和茉莉酸对火力楠幼苗盐胁迫均有缓解作用，经过综合评价发现盐胁迫下3 mmol·L-1茉莉酸甲酯、100 mg·L-1水杨酸、5 mmol·L-1氯化钙处理均具有减少对火力楠幼苗伤害的功效，但盐胁迫对植物的影响机制比较复杂，因此有关外源物质对火力楠生理生化的影响尚需要进一步研究。