博舒替尼对缺氧损伤血管内皮细胞迁移能力的影响

马梦尧，张 冉，钟文华，刘 云，张 艺，吴 超，苏欣宇，王 林，胡泽波，李 曙

(皖南医学院 病理生理学教研室，安徽 芜湖 241002)

缺血性脑卒中是一种严重损害健康的临床常见疾病[1]，血管内皮细胞缺氧是缺血性脑卒中发病的首发事件[2]。通过促进缺血区域的血管再生，可有效减少缺血区域血脑屏障的破坏，减轻缺血区组织损伤，延长溶栓疗法的治疗时间窗。

博舒替尼是酪氨酸酶抑制剂中的一种，在临床上常被用来治疗慢性髓性白血病。有研究表明，博舒替尼可以抑制盐诱导激酶2(salt-inducible kinase 2，SIK2)的表达[3]。我们前期的研究表明，SIK2可以抑制血管生成[4]。本研究采用博舒替尼作用于CoCl2诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical rein endothelial cells,HUVECs)缺氧损伤模型[5]，探讨其对HUVEC损伤后迁移能力的影响及可能的作用机制，以期为延长缺血性脑卒中的溶栓治疗时间窗提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 HUVECs(南京凯基生物公司)；DMEM高糖的培养基(HyClone，USA)；胎牛血清(CLARK，USA)；磷酸盐缓冲液PBS(HyClone，USA)；CoCl2(sigma，USA)；博舒替尼(Beyotime，China)；Transwell Corning 3422(Corning，USA)；CCK-8(DOJINDO，China)；SIK2兔多克隆抗体(Thermo，USA)；β-actin鼠多克隆抗体(Beyotime，China)；HRP山羊抗兔抗体(Beyotime，China)；山羊抗鼠抗体(Beyotime，China)；细胞的程序冻存盒(Thermo，USA)；化学发光凝胶成像系统(BIO-RAD，USA)；酶标仪(SpectraMax M2，USA)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HUVECs用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，放置在37℃、5%CO2培养箱中，每隔两天换液，取对数生长期细胞实验。

1.2.2 建立CoCl2缺氧损伤模型 将HUVECs细胞种入96孔板(1×104个/mL)，24 h后更换成100 μL终浓度分别为350、300、250、200、150、100、50、0 μmol/L的含CoCl2的无血清培养基，每组设6个复孔，24 h后加入10 μL CCK-8，2 h后在酶标仪450 nm波长(600 nm波长参比)下测各组光密度(OD)值。取100 μL 250 μmol/L CoCl2分别作用于HUVECs 0、3、6、12、24、48 h，通过CCK-8法进一步筛取最佳时间。

1.2.3 测定细胞培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量 将HUVECs细胞制成悬液，用移液枪种入96孔板内(1×104个/mL)，待细胞长满孔底后弃去培养基，加入LDH释放试剂孵育1 h后，离心取上清并随即进行样品测定。

1.2.4 划痕实验法测定细胞迁移率 6孔板背面用Marker笔做辅助线，接种HUVECs细胞悬液并加入含丝裂原霉素C(1 μg/mL)铺满孔底后待过夜，用200 μL枪头垂直横线划痕。PBS清洗3次，加入含2%胎牛血清的培养基。按对照组、CoCl2缺氧损伤组、博舒替尼治疗组分别以0、24 h为时间点取样拍照。随机选取40×视野拍照比较细胞迁移程度，迁移程度=(0 h两侧平均距离-24 h两侧平均距离)/0 h两侧平均距离。

1.2.5 Transwell实验法测定细胞迁移率 实验分为对照组、CoCl2缺氧损伤组、博舒替尼治疗组3组。将饥饿处理后的HUVECs制成1×105个/mL浓度的混悬液，取200 μL 2% FBS细胞悬液置于Transwell上室，在Transwell下室加入800 μL含有20% FBS的DMEM高糖完全培养基。待孵育24 h后，镊子去除小室，用棉签伸进上室轻轻旋转擦拭，接着PBS清洗，100%甲醇固定下室面细胞30 min，再用0.5%结晶紫染色20 min，擦净上室后镜检，随机选取5个200×视野拍照，比较细胞数量。

1.2.6 Western blot法检测SIK2蛋白的相对表达 冰上裂解提取6孔板中细胞的蛋白，BCA法测浓度。以每泳道35 μg蛋白上样，通过电泳分离蛋白后，将蛋白转移到NC膜上，再封闭80 min，洗净，一抗过夜。次日待体系温度恢复室温后回收一抗，TBST每次5 min洗涤3次，加入1∶1 000二抗孵育2 h，再次用TBST每次5 min洗涤3次，ECL试剂盒曝光显色。采用Image J对蛋白条带进行分析。

1.2.7 蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析SIK2相关蛋白 使用STRING数据库(https://string-db.org)找到SIK2及其上下游蛋白，通过京都基因和基因组百科全书比较相关蛋白通路并进行富集分析。

2 结果

2.1 CoCl2的有效作用浓度与作用时间 CCK-8结果表明，低浓度的CoCl2(250 μmol/L以下)不影响HUVECs的增殖(P>0.05)；当CoCl2的浓度达到250 μmol/L时，细胞增殖率(0.743 0±0.028 1)与对照组(0.968 1±0.027 6)相比开始出现抑制(P<0.05)；时间梯度实验结果表明，当CoCl2作用时间延长到24 h时，抑制效果(0.396 3±0.036 1)最为明显(P<0.05)。见图1。

2.2 CoCl2对内皮细胞凋亡的影响 LDH结果表明，对照组[(14.638 9±0.820 8)mU/μL]和CoCl2缺氧损伤组[(15.362 1±0.613 8)mU/μL]的LDH含量差异无统计学意义(P>0.05)，细胞未出现大量凋亡、坏死。见图2。

LDH含量(n=6，t=1.728，P=0.115)。

2.3 博舒替尼对细胞迁移能力的影响 划痕实验结果显示，与对照组(38.47±2.81)%相比CoCl2缺氧损伤组迁移率(13.10±1.11)%下降(P<0.05)；联用博舒替尼治疗组(19.37±2.14)%与CoCl2缺氧损伤组相比迁移率有所升高(P<0.05)；Transwell的结果表明，各组穿孔细胞数差异明显。取CoCl2缺氧损伤组、联用博舒替尼治疗组同对照组穿孔细胞数目的比值并进行统计，CoCl2缺氧损伤组迁移率(57.87±8.20)%下降(P<0.05)，联用博舒替尼治疗组迁移率(80.64±10.81)%有所升高(P<0.05)。见图3。

A.划痕实验；B.划痕实验细胞迁移率(n=3，F=114.269，P=0.000；vs.对照组，**P<0.01；vs.博舒替尼组，*P<0.05)；C.Transwell实验；D.Transwell实验细胞迁移率(n=3，F=18.550，P=0.000；vs.对照组，**P<0.01；vs. 博舒替尼组，*P<0.05)。标尺=50 μm。

2.4 博舒替尼对SIK2蛋白表达的影响 各组细胞SIK2蛋白表达及水平检测如下。与CoCl2损伤组相比，博舒替尼治疗组SIK2蛋白表达下降(P<0.05)。见图4。

A.Western blot检测结果；B.SIK2在各组中蛋白的表达(n=3，F=114.269，P=0.000；vs. CoCl2缺氧损伤组，**P<0.01)。

2.5 SIK2相关蛋白PPI及KEGG分析 在STRING数据库(https://string-db.org)中找出与之相关的蛋白(CRTC、CREB、HIF-1、COX-2、TGF、ANG、PDGF、AKT、PI3K、MAPK、FAK、MEK、PKC、ERK、FAK、mTOR、PLC、P38)同SIK2之间的互作关系，见图5。富集分析上述蛋白，结果匹配106条KEGG通路，取显著的前10条通路，见表1。

图5 SIK2相关蛋白相互作用网络分析

表1 KEGG途径富集分析

3 讨论

博舒替尼是酪氨酸酶抑制剂中的一种[6]，常被用来治疗正处于慢性、加速期或急变期(既往治疗无效)的慢性髓性白血病患者。有研究表明，博舒替尼可以抑制小鼠体内SIK2的表达[3]。SIK2是一种丝/苏氨酸蛋白激酶[7]，隶属于AMP活化蛋白激酶家族。对SIK2最初的研究集中在糖脂代谢、肿瘤预后、细胞周期调控、黑色素合成等方面[8-14]。最近的研究表明，SIK2在缺血性脑卒中的发病中也具有重要作用，其可以维持神经元中cAMP调控的转录共激活因子1(CREB-regulated transcription coactivator-1，CRTC1)的磷酸化及游离状态，避免CRTC1进入胞核与环磷腺苷效应元件结合蛋白(CRE response element-binding protein，CREB)相结合发挥作用。脑缺血损伤发生后，大量SIK2 降解并解除对CRTC1的抑制，继而导致神经元存活率明显增加[7]。我们的前期研究表明，在缺血再灌注损伤中SIK2可通过促血管生成的方式来减轻机体损伤[4]。这些结果提示SIK2可能不仅通过维持CRTC1的磷酸化来保护神经元，还可通过促进血管生成来减轻缺血区的损伤，但其发挥作用的具体机制仍然需要探索。

本研究成功建立HUVECs缺氧损伤模型，通过CCK-8法测定细胞增殖率，筛选CoCl2最佳浓度与作用时间并最终选用250 μmol/L CoCl2作用24 h建立模型，该模型能在体外准确模拟脑缺血损伤初期。LDH在胞浆内广泛存在，细胞发生凋亡时，胞浆内的高浓度LDH可以顺浓度梯度渗透入培养液中，因而可测量上清LDH来评价损伤情况。通过检测该模型上清液中的LDH含量，发现无明显变化，细胞未发生大量死亡，可较准确的判断细胞迁移情况。且Hoechst荧光结果也证明了这个结论。将博舒替尼作用于HUVECs缺氧损伤模型，结果表明博舒替尼治疗可以有效地改善缺氧HUVECs的迁移能力，与CoCl2缺氧损伤组相比，博舒替尼治疗组降低了SIK2蛋白的表达，这表明SIK2可能与HUVECs迁移能力相关。通过对SIK2及相关蛋白作PPI及KEGG分析，表明SIK2可能通过CREB调控来实现其迁移能力的抑制作用。

血管生成是缺血性脑卒中预后的重要指标[15]。细胞增殖、迁移是血管生成最早的标志之一[16-17]，也是血管生成级联反应的早期步骤之一[18-19]。本研究结果表明，在HUVECs建立的缺氧损伤模型里，博舒替尼有可能通过抑制SIK2促进HUVECs迁移进而发挥促进血管生成的作用。但是是否通过SIK2-CRTC1-CREB这一相互作用链实现进而促进HUVECs迁移，这一点还需要进行免疫共沉淀等进一步的试验进行验证，后续我们将进一步扩大对相关蛋白指标的测定，为进一步探究SIK2在脑卒中发病中的作用，进而为患者寻找新型早期有效的诊断及预后标志物奠定基础。