表面增强拉曼光谱快速检测抗风湿类中成药中非法添加的美洛昔康

龚娅军， 姚卫蓉， 谢云飞

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

目前，抗风湿类中成药中美洛昔康的检测手段单一，主要集中在高效液相色谱以及高效液相色谱串联质谱[1-3]。拉曼光谱是一种指纹图谱，能提供分子振动和转动的信息，而每一种物质在单色强光的照射下都能产生特定的分子振动能和转动能变化，因此每一种物质都对应一种特定的拉曼光谱，所以被应用于物质的定性检测[4]。但常规的拉曼光谱受到其很弱的拉曼信号的限制，没能被广泛应用[5]。表面增强拉曼光谱（SERS）可以通过强化基底的物理和化学增强，极大提高SERS的信号强度，甚至实现单分子检测[6-7]。SERS以其独特的优势，例如灵敏度高、操作快速简便以及可以实现无损检测等被广泛应用在食品分析[8-9]、生物医学[10-11]以及环境监督中[12-13]。近年来，贵金属纳米粒子修饰的纳米阵列作为SERS增强基底引起了研究者们广泛的兴趣，该基底SERS增强效果好，具有良好的重现性以及稳定性。Lin等制备了大面积金纳米粒子修饰的硅纳米棒，其增强因子达到107，并且发现长淀粉样蛋白-β原纤维能在此基底上产生超敏感拉曼信号，这为与阿尔茨海默病相关的淀粉样蛋白聚集体的检测提供了支撑[14]。Lee等利用斜角沉积的方法在硅纳米阵列上用金纳米粒子修饰，其增强因子达到1.78×106，并且将其应用到实际的检测中，可检测浓度为0.01~100μmol/L的孔雀石绿[15]。Wei等通过将DNA链固定在金纳米粒子修饰的硅纳米线阵列，用有机染料标记的寡核苷酸捕获和报告探针，可检测浓度低至10 fmol/L的DNA[16]。

作者通过金属辅助的化学刻蚀与无电沉积的方式，制备一种银纳米枝晶修饰的硅纳米阵列（silver nanodendrite-modified silicon nanoarrays，AgND/SiNWs），将其作为表面增强拉曼光谱的增强基底应用于美洛昔康的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硅片（P-100，单面抛光，5~10Ω·cm，厚度（525±25）μm）：苏州锐材半导体有限公司产品；美洛昔康对照品（99.99%）：中检所产品；丙酮（色谱纯）、无水乙醇（色谱纯）、过氧化氢（分析纯）、氢氟酸（分析纯）、硝酸（分析纯）、乙腈（色谱纯）、硝酸银（基准）、硝酸铁（分析纯）、硼氢化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司产品；超纯水：广州屈臣氏食品饮料有限公司产品；复方蚂蚁活络胶囊：四平正和制药有限公司产品。

1.2 仪器与设备

便携式拉曼光谱仪（RamTracer®-200-HS）：OptoTrace Technologies公司产品；有机滤膜（0.45 μm）：上海安谱公司产品；聚四氟乙烯烧杯：上海申迪玻璃仪器有限公司产品；聚四氟乙烯坩埚：上海申迪玻璃仪器有限公司产品；聚四氟乙烯镊子：苏州锐材半导体有限公司产品；分析天平（AB104-N）：梅特勒-托利多国际股份有限公司产品；超声波清洗仪（KH-500B）：昆山禾创超声仪器有限公司产品；可调式移液枪：Dragon-Lab公司产品；SU8100冷场发射扫描电子显微镜：日本株式会社日立高新技术公司产品；X射线衍射仪（D2 PHASER）：德国布鲁克AXS有限公司产品；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司产品。

1.3 方法

1.3.1 拉曼检测条件 扫描功率300 mW，激发波长785 nm，积分时间5 s，积分次数3次。

1.3.2 AgND/SiNWs的合成 首先，将P型单面抛光的硅片切割成1.5 cm×1.5 cm的片状，依次用丙酮、无水乙醇以及超纯水超声清洗10 min，室温自然晾干。晾干的硅片浸入HF（4.6 mol/L）与AgNO3（0.44 mol/L）溶液中10 s，在其表面形成银网络，银作为催化剂参与下一步的刻蚀反应。后将硅片浸入刻蚀液中进行一定时间的刻蚀，获得表面有一定深度的阵列，为下一步银纳米粒子的沉积提供极大的比表面积。接着将处理好的硅片浸入HF（4.6 mol/L）与AgNO3（0.01 mol/L））溶液中一定时间，以获得AgND/SiNWs。最后在体积分数5%的硝酸溶液中浸泡15 min，超纯水冲洗表面，取出，室温晾干，备用。

1.3.3 样品预处理 称取0.3 g样品，加乙腈30 mL，超声提取15 min，冷却至室温后转移至50 mL容量瓶中，并用乙腈稀释至刻度。过滤，滤液备用；样品加标处理：称取0.3 g样品，加乙腈30 mL，加标质量浓度为2、10、20μg/mL，超声提取15 min，冷却至室温后转移至50 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度。过滤，滤液备用。

2 结果与分析

2.1 美洛昔康分子的理论计算与拉曼归属指认

分别使用HyperChem、Gaussian09对美洛昔康分子进行结构优化，然后对最优结构进行拉曼位移的理论计算。优化时，采用密度泛函方法中的b3lyp方法，并结合6-311+g（d）基组，分子结构优化结果如图1所示；之后将关键字设为：p opt freq=raman，geom=connectivity，对分子进行拉曼位移的理论计算（校正因子为0.968 0），如图2所示，与固体美洛昔康的普通拉曼光谱图对比，光谱图基本一致。使用GaussianView5.0观察和分析计算结果，并使用Veda4进行PED（振动归属指认）分析，对美洛昔康分子在拉曼光谱中的各个振动峰及其贡献率进行归属指认，见表1。

图1 美洛昔康的分子结构优化图Fig.1 Optimized molecular structure of meloxicam

图2中美洛昔康分子的理论计算与固体分子的普通拉曼光谱图稍有差别但总体基本一致，究其原因，理论计算时考虑的仅仅是单个分子在理想状态下的拉曼光谱，而实际样品中是很多分子聚集在一起的状态，因而导致理论计算与实验光谱有一定的拉曼位移差异，但是绝大多数的理论计算光谱与实验光谱具备很好的吻合度，对拉曼特征峰的归属以及指认具有一定的指导作用。

图2 美洛昔康的实验拉曼光谱和理论拉曼光谱Fig.2 Experimental and theoretical Raman spectrum of meloxicam

通过PED分析得出表1并结合图1、图2可以看出，对美洛昔康的拉曼光谱贡献率最大的特征峰为670、1 032、1 116、1 160、1 264、1 304、1 470、1 530、1 592 cm-1，其中，670 cm-1处为C27—S28以及S28—C27=N32的伸缩振动，主要是S28—C27=N32的伸缩振动，贡献率为37%；1 032 cm-1处为苯环内C8—C9伸缩振动以及N18—C19的伸缩振动；1 116 cm-1处为S=O的振动；1 160 cm-1处为苯环内C6—C9、H20—C19—N18—S15以 及 H21—C19—N18—S15的振动；1 304 cm-1处为S=O的振动；1 470 cm-1以及1 530 cm-1处为—CH3的伸缩振动；1 592 cm-1处为环内N32=C27以及C29=C30的振动。

表1 美洛昔康理论计算以及实验拉曼光谱特征峰及振动归属表Table 1 Experimental and calculated Raman spectrum in frequency and assignment of meloxicam

2.2 AgND/SiNWs的SERS增强性能

为确定AgND/SiNWs对美洛昔康的SERS增强效果，图3给出了美洛昔康及其在未刻蚀硅片和AgND/SiNWs上的拉曼光谱。从图3可以看出，美洛昔康在锡箔纸上经普通拉曼检测没有任何拉曼信号，光谱中出现的拉曼峰为溶剂乙腈在918、1 374 cm-1处的拉曼位移；在未刻蚀的硅片上同样观察不到美洛昔康的拉曼信号，只在520 cm-1处出现单晶硅的拉曼特征峰；而在AgND/SiNWs上观察到很强的拉曼信号，同样在520 cm-1处也出现了单晶硅的拉曼信号，证明制备的基底具有很好的SERS增强效果。

图3 美洛昔康乙腈溶液在锡箔纸上（a）、在未经蚀刻的硅片上（b）及AgND/SiNWs上（c）的拉曼光谱图Fig.3 Raman spectra of meloxicam acetonitrile solution in aluminum foil(a)，unetched silicon wafter(b)and AgND/SiNWs(c)

2.3 AgND/SiNWs制备条件优化

比较不同氧化剂对硅纳米阵列形成过程的影响，从而可改变基底的SERS增强效果。分别使用硝酸铁（AgND/SiNWs2）、过氧化氢（AgND/SiNWs1）作为氧化剂，与氢氟酸组成2种刻蚀溶液，制备得到2种基底，对美洛昔康的增强效果见图4（a）。过氧化氢作为氧化剂时制备得到的AgND/SiNWs对美洛昔康的SERS增强性能优于硝酸铁作为氧化剂时制备得到的基底。为进一步证实过氧化氢的主导作用，将过氧化氢与硝酸铁同时作为氧化剂制备新的基底（AgND/SiNWs3），其对美洛昔康的SERS增强效果与过氧化氢单独作为氧化剂时一致（见图4（a））。在整个金属辅助的化学刻蚀过程中，根据原电池模型，涉及一个局域的微电化学过程[17-18]。简单表述为：硅片表面形成的Ag网络作为催化剂加速底部局域Si的氧化，氢氟酸将氧化后的Si溶解刻蚀后，洗去Ag网络层，剩下的Si就形成了SiNWs。Si的氧化可能是形成SiNWs重要的前驱，而为了加速Si的氧化，必须维持一定浓度的自由Ag+。在HFH2O2-H2O体系中，H2O2不仅作为氧化剂参与其中，并且可以溶解Ag纳米颗粒，从而维持溶液中一定浓度的自由Ag+；而在HF-Fe（NO3）3-H2O体系中，有文献指出[19]，在Fe（NO3）3作为氧化剂参与反应时，对于SiNWs的形成起重要作用的是NO3-离子，并非Fe3+离子，这可能是HF-H2O2-H2O体系制备的SiNWs对于美洛昔康的SERS增强效果优于HF-Fe（NO3）3-H2O体系的原因。

金属辅助的化学刻蚀制备硅纳米阵列分为一步法与两步法。为了探究哪种方法制备的基底对美洛昔康的SERS增强效果更好，采用两种方法制备AgND/SiNWs，评价其SERS增强效果。结果如图4（b）所示。由两步法制备的基底对美洛昔康的SERS增强效果明显比一步法好。这是因为在一步法制备基底的过程中，硅片直接浸入由HF/AgNO3/H2O2组成的溶液，而H2O2对Ag颗粒的生长有阻碍作用，加入H2O2后溶液中光激发的空穴增加，电子减少，所以Ag+无法捕获更多的e-，进而析出更多的Ag颗粒，使得制备的基底SERS增强效果差于两步法[20]。

图4 美洛昔康在不同硅纳米阵列的拉曼光谱及硅纳米阵列的扫描电镜图Fig.4 Raman spectrum of meloxicam in different AgND/SiNWs and the SEM images of different AgNDs/SiNWs

实验发现，刻蚀时间对硅纳米阵列的形成也有一定影响，从而影响其SERS增强效果。图4（c）显示在刻蚀时间为25 min时，基底的SERS增强效果最好，图4（e）为不同刻蚀时间（10、25、40 min）制备的硅纳米阵列截面的扫描电镜图。可以看出，随着刻蚀时间延长，硅纳米阵列的长度也随之增加，与文献结果一致。

通过改变镀银时间来制备不同的AgNDs/SiNWs，图4（d）给出了不同镀银时间生成的AgNDs/SiNWs对美洛昔康的SERS增强效果图，镀银时间为120 s时，其SERS增强效果最好。镀银的过程实际上是一个还原反应。初期，相对较高浓度的银盐和还原剂导致银核的生长，在SiNWs的顶部形成微小的AgNPs，随着反应的继续，银盐和还原剂的浓度都随之降低，此时银的生长主要是由表面能的降低驱动的，从而形成AgNDs。纳米级的枝晶缝隙将大大增强拉曼信号强度。当反应时间延长到180 s，不规则的AgNDs将影响SERS增强效果[21-23]。图4（f）为其扫描电镜图，可以看出，随着镀银时间由0 s增加至60 s，银纳米枝晶侧面的枝晶也逐渐增多，到120 s时，可以看到银纳米枝晶的分布比较整齐、均匀，当时间延长至180 s时，生成的枝晶多而不规则。

2.4 重现性

以目标物美洛昔康为探针分子来探究其重现性，结果如图5所示。10次扫描的结果具有较高的重现性，为了定量评估，计算其相对标准偏差RSD。结合表2，美洛昔康9个特征峰强度平均RSD为11%。

表2 美洛昔康10次扫描结果及RSDTable 2 10 scan results and RSD of meloxicam

图5 美洛昔康在AgNDs/SiNWs上的连续扫描拉曼光谱图Fig.5 Raman spectra of meloxicam in AgNDs/SiNWs with continuous scanning

2.5 可重复利用性

以目标物美洛昔康为探针分子，探究基底的可重复利用性。图6（a）给出了经过不同的清洗时间后，基底上残留的美洛昔康的拉曼光谱图。可以看出，清洗时间由10 s增加至50 s，仍然可以分辨出美洛昔康在1 592、1 530、1 116、1 032 cm-1等处的位移。当清洗时间延长至70 s，基本分辨不出美洛昔康的特征峰。图6（b）是美洛昔康在清洗70 s、清洗7次的AgNDs/SiNWs上的拉曼光谱图。随着清洗次数的增加，特征峰的强度也逐渐降低，到第7次，美洛昔康的特征峰强度明显下降，可认为该基底清洗时间70 s，可重复利用7次。

图6 美洛昔康在AgNDs/SiNWs上的拉曼光谱图Fig.6 Raman spectra of meloxicam on AgNDs/SiNWs

2.6 储存稳定性

为探究制备的AgNDs/SiNWs基底的时间稳定性，以目标物美洛昔康为探针分子，放置不同时间后进行拉曼测试，结果如图7所示。制备的AgNDs/SiNWs在4 d内几乎保持一致的SERS增强效果，稳定性较好，美洛昔康的主要特征峰强度降低幅度很小。在第96天时，仍然能清楚地分辨美洛昔康的主要特征峰。该结果表明，AgNDs/SiNWs基底时间稳定性好，且在距离制备时间越短使用，其SERS增强效果越明显。放置96 d的AgNDs/SiNWs增强信号有所减弱，但仍可使用。

图7 AgNDs/SiNWs放置不同时间后对美洛昔康的增强效果对比Fig.7 Comparison of the Raman spectra of meloxicam AgNDs/SiNWs in different time

3 方法应用

3.1 目标检测物质的确定

将2个质量浓度的美洛昔康对照品溶液的拉曼光谱图与其固体粉末的拉曼光谱图比较，确定目标检测物质。由图8可以看出，在670、1 032、1 116、1 160、1 264、1 304、1 470、1 530、1 592 cm-1处，两者拉曼位移一致，可以确定检测物质，并且可将其作为美洛昔康的定性依据。

图8 质量浓度为25、100μg/mL的美洛昔康对照品溶液与其固体拉曼光谱图Fig.8 Raman spectra of meloxicam in solid state,25μg/mL and 100μg/mL

3.2 基底与待测液接触方式对SERS增强效果的影响

待测液与基底的接触方式对SERS增强效果有影响。作者选取的2种接触方式为浸泡和滴加。图9显示了2种接触方式对SERS增强效果的影响。可以看出，浸泡与滴加2种方式的SERS增强效果没有显著差别。

图9 浸泡与滴加两种接触方式检测的美洛昔康拉曼光谱图Fig.9 Raman spectra of meloxicam detected by two contact methods

3.3 待测溶液滴加体积对SERS增强效果的影响

待测液的体积可影响目标分子在AgNDs/SiNWs基底上的吸附情况，从而对SERS增强效果产生影响。图10显示了在同一批制备的AgNDs/SiNWs基底上滴加不同体积美洛昔康的拉曼光谱图。可以看出，当美洛昔康的体积逐渐增加到5μL以后，美洛昔康的主要特征峰峰形及其峰的强度几乎不再发生变化。因此，后续实验均采用滴加体积5μL的检测方法。

图10 不同体积的美洛昔康溶液的拉曼光谱图Fig.10 Raman spectra of meloxicam solution with different volume

3.4 检测时间对SERS增强效果的影响

图11 显示了美洛昔康在AgNDs/SiNWs基底上进行连续检测的拉曼信号强度对比。可以看出，随着检测时间的延长，美洛昔康在AgNDs/SiNWs基底上的拉曼特征峰峰形及其强度几乎保持不变。检测时间影响SERS增强效果一方面在于其会影响待测分子与基底的结合强度，而实验中的溶剂均为乙腈，挥发性极好，少量的待测液滴加到基底上很快便会挥发从而只留下待测分子，所以检测时间对其几乎不产生影响。

图11 不同检测时间下美洛昔康的拉曼光谱图Fig.11 Raman spectra of meloxicam detected under different adsorption time

3.5 最低检测浓度以及线性相关性的确定

图12 （a）显示了不同质量浓度的美洛昔康在AgNDs/SiNWs上的拉曼光谱图。可以看出，随着美洛昔康的质量浓度降低，其主要拉曼特征峰的强度也随之下降，直到质量浓度下降至0.1μg/mL，仍然可以大致分辨其拉曼特征峰，当质量浓度继续下降至0.05μg/mL时，几乎观察不到美洛昔康主要的拉曼特征峰，所以该方法最低检测质量浓度为0.1μg/mL。并且在1 160 cm-1处，拉曼特征峰的强度（即峰的高度）与其质量浓度在0.1~25μg/mL呈线性相关性（y=8.688 7x+89.945 9，R2=0.992 3），线性关系良好（见图12（b））。

图12 不同质量浓度的美洛昔康拉曼光谱图及线性关系图Fig.12 Raman spectra and linear diagrams of meloxicam with different mass concentrations

3.6 加标回收实验

为了验证该方法对实际样品的检测效果，对市售的抗风湿类中成药复方蚂蚁活络胶囊中的美洛昔康进行检测，结果如图13所示。空白样品的拉曼光谱图中没有出现美洛昔康的特征峰，说明实验所用的抗风湿类中成药复方蚂蚁活络胶囊中美洛昔康质量分数低于该方法的最低检测值16.7μg/g；而3个加标组（2、10、20μg/mL）的拉曼光谱图中均出现美洛昔康的拉曼信号，以1 160 cm-1处拉曼强度与美洛昔康质量浓度之间的线性关系为参考，加标回收率为80.0%~112.4%，表明该方法具有实用价值。

图13 美洛昔康固体、空白样品以及加标组的拉曼光谱图（加标质量浓度分别为2、10、20μg/mL）Fig.13 Raman spectra of meloxicam in solid state,blank sample,and liquid state with concentration of 2,10,20μg/mL

4 结 语

采用金属辅助的化学刻蚀原理制备AgNDs/SiNWs，调节刻蚀条件，对基底的SERS增强效果进行了研究。具体内容如下：通过改变刻蚀液种类、刻蚀方法、刻蚀时间以及镀银时间，制备出SERS增强效果更好的AgNDs/SiNWs。具体选择HF-H2O2-H2O体系作为刻蚀液，采用两步法，刻蚀时间25 min，镀银时间120 s的刻蚀条件。优化采用该基底检测美洛昔康的检测条件，将5μL美洛昔康滴加在AgNDs/SiNWs上进行拉曼检测，最低检测质量浓度为0.1μg/mL。对市售抗风湿类中成药复方蚂蚁活络胶囊中的美洛昔康进行检测，并计算加标回收率。实际样品中美洛昔康质量分数低于该方法最低检测值16.7μg/g，且加标回收率为80.0%~112.4%。该方法操作简单快速，对实验仪器设备要求低，为有关部门对抗风湿类中成药中的违法添加物质美洛昔康的检测提供一种新方法。