壮族冠心病患者的TLR4表达水平及其rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的多态性分析▲

周柳芳 黄达 黄照河 刘燕 周柳平 何斌 刘文静

右江民族医学院附属医院心血管内科，广西百色市 533000

冠心病(Coronary Heart Disease，CHD)尤其是急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)是目前危害人类健康的最主要疾病之一，而后者是心血管疾病的急危重症之一。目前认为，CHD慢性炎症是导致患者冠状动脉粥样硬化最重要的机制，其中Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)[1]、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)[2]、白细胞介素(Interleukin，IL)[3]等介导的炎症反应在CHD的发生、发展中起关键作用[4-5]。研究发现，Toll样受体蛋白家族中的Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的多态性与CHD的发病密切相关，但在不同区域、不同种族人群间存在巨大差别。本研究就广西壮族CHD患者的TLR4蛋白表达水平及其rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的基因多态性与CHD发病的关系进行研究，旨为评估不同人群CHD的发病风险及患者的靶向治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月至2018年1月在我院行冠状动脉造影(CAG)检查被确诊为CHD的壮族患者245例为CHD组，选取同期在我院住院治疗的非CHD壮族患者245例为对照组。纳入标准：(1)CHD组患者经冠状动脉造影(CAG)检查确诊，对照组患者根据临床表现及B超等相关检查确诊(其中高血压患者98例、糖尿病患者103例、其他疾病44例)；(2)壮族，患者及其三代及以上直系亲属均出生并长期居住于广西地区，三代及以上无与外族通婚情况；(3)患者彼此间无血缘关系；(4)患者及其家属签署检测研究知情同意书。排除标准[6-7]：(1)严重感染、恶性肿瘤、罹患严重肝肾疾病；(2)合并其他心脏疾病如先天性心脏病、酒精性心肌病、心脏瓣膜病及扩张型心肌病等；(3)曾接受再灌注治疗。两组患者的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。本研究严格按照国家人类基因组研究伦理学准则和赫尔辛基宣言进行，并得到右江民族医学院附属医院医学伦理委员会审查批准。

表1 两组患者的一般资料比较 [ n(%)，x±s ]

1.2 外周血血清TLR4蛋白表达水平检测 于早晨6:00至7:00抽取研究对象空腹静脉血5～10 mL，离心后留取上层血清，置于-20℃冰箱保存备用，采用酶联免疫吸附法(ELISA)(试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司)检测两组患者外周血血清TLR4蛋白表达水平。

1.3 外周血TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点多态性检测 研究对象采血前夜22:00后禁食，次日早晨6:00至7:00抽取空腹静脉血约2 mL置于EDTA抗凝管内。(1)采用DNA血液提取试剂盒提取外周血DNA，置于-80℃冰箱保存备用(试剂盒购自北京天根生化科技有限公司)。(2) 采用PCR技术扩增目的基因片段，TLR4基因rs4986790A/G和rs4986791C/T序列来自NCBI GenBank，引物采用Primer3软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。TLR4基因rs4986790A/G上游引物：5′-TCCATCGTTTGGTTCTGGGAGA-3′，下游引物：5′-TCACACTCACCAGGGAAAATGAAGA-3′；rs4986791C/T上游引物：5′-CCAACAAAGGTGGGAATGCTTTT-3′，下游引物：5′- TGCTGGAAATCCAGATGTTCTAGTTG-3′。10 μL PCR反应体系：1GC-I buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase，1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循环程序：95℃预变性 2 min，94℃变性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，重复11个循环；之后94℃变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，重复24个循环；72℃延伸2 min，产物置于4℃冰箱保存备用。取10 μL PCR产物，加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶纯化后进行PCR扩增。(3)取0.5 μL纯化后的延伸产物上ABI3730XL测序仪，采用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA) 分析软件进行分析(由上海天昊生物科技有限公司协助完成)。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料用%表示，组间比较采用χ2检验；正态分布的计量资料用x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者的血清TLR4蛋白表达水平比较 CHD组患者、对照组患者的血清TLR4蛋白平表达水平分别为(4.24±1.54)ng/mL和(1.07±0.43)ng/mL，两组比较差异有统计学意义(t′=31.033，P<0.05)。见图1。

图1 CHD组患者和对照组患者血清TLR4蛋白表达水平的散点柱状图

2.2 两组患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位点的多态性分布情况比较 CHD组患者、对照组患者TLR4基因rs4986790A/G位点的等位基因均为野生型A，未见突变型G；两组患者TLR4基因rs4986790A/G位点的基因型均为 AA纯合子。见图2。CHD组患者与对照组患者TLR4基因rs4986790A/G位点的等位基因及基因型频率分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图2 患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位点测序图

表2 两组患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位点的多态性分布情况比较

2.3 两组患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位点的多态性分布比较 在CHD组和对照组490例患者中，在TLR4基因rs4986791C/T位点仅检测到1例突变型T，基因型为CT杂合子(对照组患者)，其余489例患者的基因型均为野生型C。见图3。CHD组患者与对照组患者TLR4基因rs4986791C/T位点的等位基因及基因型频率分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

图3 患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位点测序图

表3 两组患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位点的多态性分布情况比较

2.4 不同地区人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的多态性分布情况比较 与人类基因组计划(Hapmap)公布的非洲人、欧洲人、日本人、印度人、北京人的TLR4基因多态性频率分布的数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)比较发现，中国广西壮族、中国北京、日本、欧洲、非洲、印度人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的基因型及等位基因的分布情况比较。见表4、表5。

表4 不同地区人群TLR4基因rs4986790A/G位点的基因型及等位基因分布情况比较 [n(%)]

表5 不同地区人群TLR4基因rs4986791C/T位点的基因型及等位基因分布情况比较 [ n(%)]

3 讨 论

TLRs是模式识别受体家族的重要成员之一，能特异性识别病原相关的分子模式 (PAMPs)，诱导炎性介质、趋化细胞因子、刺激分子的表达上调，促进炎症介质的合成和释放等一系列级联免疫炎性反应，参与感染、内分泌代谢疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、动脉粥样硬化等多种疾病的发生发展过程[8-10]。动脉粥样硬化是一种慢性炎性疾病，TLR4作为机体免疫炎症反应中重要的一环，可通过诱导机体产生IL、TNF等多种生物活性因子，造成血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增生及成纤维细胞浸润，介导及加速动脉粥样硬化(AS)的形成及发展，导致冠心病(CHD)发生[11-12]。

TLR4基因有多个位点(如rs11536889、rs1927911、rs4986790、rs4986791、rs752998、rs2149356等)，与感染、肿瘤、炎症性肠病、心血管疾病等多种疾病的发生存在关联[13-16]。Guven等[17]报道，土耳其人TLR4基因rs4986790、rs4986791位点的多态性与CHD的发病无明显关系；Ameziane等[18-19]研究发现，rs4986790位点的多态性与AS、急性冠状动脉综合征(ACS)等缺血性心血管病的发病相关，突变型G等位基因能降低缺血性心血管病的发生风险。李顺东等[20-21]报道，rs4986791位点的多态性与CHD的发病易感性相关，在CHD患者中野生型C等位基因频率较高。Di Nisio等[22]报道，TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点突变等位基因携带者的胆固醇水平低于不携带者，AS、CHD等心血管疾病的发生风险较低，可能是AS、CHD发生发展的保护因素。

本研究结果显示，CHD组患者的血清TLR4蛋白表达水平明显高于对照组，提示TLR4基因与广西壮族人群CHD发病有明显相关性。本研究中490例患者TLR4基因rs4986790A/G位点的等位基因均为野生型A，未见突变型G，基因型均为AA纯合子；在TLR4基因rs4986791C/T位点仅检测到1例突变型T等位基因，基因型为CT杂合子(对照组患者)，其余489例患者的基因型均为CC纯合子，两组患者的rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的基因型和等位基因分布情况比较差异无统计学意义，提示广西地区壮族人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点突变的可能较为罕见，TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点与壮族人群CHD发病易感性的相关性可能较弱。通过对比分析发现，中国广西、中国北京、日本、欧洲、非洲、印度人群的TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的基因型及等位基因分布比较，差异有统计学意义，提示TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的多态性分布情况在不同地区及不同人群中存在较大的差异。

综上所述，广西壮族人群外周血TLR4的表达水平与CHD患者的发病存在关联，但TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的多态性可能与壮族人群CHD发病无明显的相关性。不同地区、不同种族人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位点的多态性分布情况存在显著差异。