烤烟种质资源物理特性的遗传多样性分析

吴兴富，焦芳婵，冯智宇，陈学军，张光海，李永平

云南省烟草农业科学研究院，昆明市五华区圆通街33号 650021

烟草种质资源是新品种选育的材料基础，种质资源遗传多样性可反映其遗传背景、育种潜力和利用价值，遗传多样性研究对发掘利用资源、亲本选择、拓宽育成品种遗传基础和保护优异种质具有重要意义［1]。在烟草种质资源遗传多样性研究方面，基于分子标记的遗传多样性研究报道较多［2-5]，表型遗传多样性研究报道较少［5-7]，但这些研究未涉及烟叶物理特性。烤烟物理特性作为烟叶品质的重要组成部分，其中含梗率、填充值和平衡含水率等是卷烟加工性能的重要指标，直接影响卷烟加工工艺、产品风格、成本及经济效益［8]。目前，烤烟物理特性相关研究主要集中在不同品种烟叶物理特性差异［9-10]、特定产区烟叶物理特性［11-12]以及物理特性与烟叶外观品质［13-14]、化学成分含量（质量分数）［15-18]、感官品质［19-20]的关系等方面。杨虹琦等［10]研究表明，同一栽培条件下不同烤烟品种烟叶含梗率存在显著差异;尹启生等［11]研究提出了我国烤烟中部叶的叶面密度、拉力、填充值、平衡含水率、含梗率、单叶质量等物理特性指标的范围；付秋娟等［13]研究提出烤烟物理特性与外观品质关系密切。王建民等［18]试验认为，填充值、叶面密度与总糖和还原糖呈负相关，平衡含水率与总植物碱呈负相关，填充值与总氮和氯量呈正相关，叶面密度与总植物碱和总氮呈正相关，平衡含水率与总糖和还原糖呈正相关;刘阳等［20]研究表明，在较适宜范围内的单叶质量、含梗率与感官品质显著相关。但有关烤烟种质资源物理特性的遗传多样性研究尚鲜见报道。为此，采用检测遗传变异最传统和直观的表型性状研究方法［21]，对269份烤烟资源C3F烟叶的6个物理特性指标的表型进行遗传多样性分析和R语言聚类分析，以期为烤烟物理特性优异的种质筛选、育种亲本选择以及品种改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验方法

2018年在云南石林板桥种植269份烤烟种质资源，包括129份国内种质资源（编号1～129），140份国外种质资源（编号130～269）。其中美国种质资源102份（编号130～231）、其他来源种质资源38份（编号232～269）。每份种质资源种植50株，采用膜下小苗移栽，行距120 cm，株距50 cm，田间管理按当地优质烟叶生产技术规范操作。大田烟株中心花开放时打顶，烟叶适熟采收，采用烤烟生产中最常用的密集烤房（气流下降式）和三段式烘烤工艺对参试烟叶进行烘烤。烟叶烘烤结束后，每份种质资源取C3F烟叶2 kg，用于物理特性指标的测定。

1.2 物理特性指标检测

按照YQ-YS/T 1—2018标准方法［22]，测定参试种质资源C3F烟叶的叶面密度、单叶质量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值。

1.3 数据处理

利用Excel计算参试种质资源6个物理特性指标的最大值、最小值、极差、平均值、标准差和变异系数（CV）。参照王继师等［23]的方法，将每个指标划分为10级，从第1级＜X-2S到第10级≥X+2S，中间隔0.5S为1级。X为平均值，S为标准差，计算各指标每一级的相对频率，然后按照公式（1）计算Shannon-Weaver遗传多样性指数（H′），并用各指标多样性指数的平均值表示一类或所有种质资源的遗传多样性程度。

按YQ-YS/T 1—2018标准［22]中的西南烟区烤烟物理特性指标评分赋值法（见表1），利用公式（2）计算参试种质资源物理特性指标分值［18]。

计算公式：

式中：H′为Shannon-Weaver遗传多样性指数；Pi为某指标第i级的频率；ln为自然对数。

式中：G为物理特性分值；Fi为第i个物理特性指标的量化分值，各个指标的量化分值由表1计算得出；Hi为第i个物理特性指标的权重，叶面密度、单叶质量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的权重分别为0.14、0.20、0.21、0.08、0.17和0.20。

为便于描述，根据表1评分赋值，将物理特性指标适宜性划分为4档，即评分赋值100、100～80、80～60、＜60的适宜性依次为最适宜、适宜、次适宜和不适宜，叶面密度、单叶质量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的最适宜范围分别为70.0～75.0 g/m2、9.0～11.0 g、1.8～2.0 N、≥13.5%、≤25.0%、≥4.3 cm3/g，适宜范围分别为60.0～70.0 g/m2或75.0～85.0 g/m2、7.0～9.0 g或11.0～13.0 g、1.4～1.8 N或2.0～2.4 N、12.0%～13.5%、25.0%～31.0%、3.9～4.3 cm3/g，各指标次适宜和不适宜的范围依此类推。

表1 烤烟物理特性指标评分赋值（西南烟区）Tab.1 Assignment for physical characteristic indexes of flue-cured tobacco from southwest tobacco growing areas

利用R语言软件，对269份种质资源6个物理特性指标进行数据标准化处理，用皮尔逊相关系数距离法（Pearson correlation distance）计算距离，然后用平均值进行层次聚类。同时，采用完全随机分析方法，对不同类别种质资源和聚类分析的6个物理特性指标和二级统计指标均值进行差异显著性检验（新复极差法）。

2 结果与分析

2.1 参试种质资源物理特性指标描述性统计及频率分布

参试种质资源6个物理特性指标统计结果（表2）表明，变异系数以填充值最大（20.25%），平衡含水率最小（6.73%），平均为15.88%，说明物理特性指标差异较大。6个指标的遗传多样性指数以含梗率最大（2.050），填充值最小（1.934），平均为2.014，说明物理特性遗传多样性较丰富。同时，从各指标均值适宜性（表2）来看，平衡含水率（17.0%）最适宜（＞13.5%），填充值（3.2 cm3/g）不适宜（＜3.4 cm3/g），叶面密度（83.8 g/m2）、单叶质量（12.5 g）、拉力（2.1 N）和含梗率（28.7%）适宜。

表2 参试种质资源的物理特性描述性统计及遗传多样性分析Tab.2 Descriptive statistics and genetic diversity analysis of physical characteristic of experimental germplasm resources

从6个物理特性指标基于10级分类的频率分布（图1）来看，6个指标并非平均分布，而是在不同数值范围内具有一定的集中性，叶面密度、单叶质量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的集中分布范围分别为67.5～92.0 g/m2、10.2～13.7 g、2.1～2.5 N、16.5%～18.2%、24.3%～33.1%和2.6～3.5 cm3/g，分布频率依次为56.9%、62.8%、57.6%、60.6%、71.0%和65.1%。从物理特性指标适宜性来看，参试种质资源叶面密度、单叶质量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值最适宜范围分布频率分别为11.5%（31份）、18.6%（50份）、20.1%（54份）、99.3%（267份）、20.1%（54份）和9.7%（26份）。可见，参试种质资源中平衡含水率优异的种质资源丰富，填充值和叶面密度优异的种质资源相对匮乏，单叶质量、拉力和含梗率优异的种质资源较丰富。

2.2 参试种质资源物理特性的遗传多样性分析

从不同来源种质资源（表3）来看，除单叶质量外，其他5个指标及物理特性分值的差异达到显著或极显著水平，国内种质资源的拉力大于其他种质资源，含梗率高于美国种质资源，填充值大于美国种质资源，物理特性分值高于美国种质资源，叶面密度小于美国和其他种质资源，平衡含水率低于美国种质资源。美国种质资源的平衡含水率比其他种质资源稍高，含梗率低于其他种质资源，填充值小于其他种质资源，物理特性分值略低于其他种质资源。从遗传多样性指数看，国内种质资源中拉力、平衡含水率和填充值的H′略高于美国种质资源，叶面密度的H′略低于美国种质资源，单叶质量、平衡含水率的H′略高于其他种质资源，填充值的H′略低于其他种质资源。美国种质资源叶面密度、单叶质量和含梗率的H′略高于其他种质资源，拉力和填充值的H′略低于其他种质资源。国内种质资源物理特性分值的H′（2.049）略高于美国种质资源（1.956）和其他种质资源（2.000），6个物理特性指标的平均H′（1.979）略高于美国种质资源（1.956）和其他种质资源（1.932）。可见，国内种质资源物理特性指标的遗传多样性比国外种质资源稍丰富。

表3 不同来源种质资源的物理特性遗传多样性①Tab.3 Genetic diversity of physical characteristics of germplasm resources from different sources

2.3 国内地方和杂交选育种质资源的物理特性遗传多样性差异分析

国内种质资源来源明确的72份地方种质资源和40份杂交选育种质资源的物理特性指标见表4。方差分析结果表明，地方种质资源和杂交选育种质资源的各物理特性指标间差异未达到显著水平。从H′来看，地方种质资源的叶面密度、单叶质量、拉力、平衡含水率、含梗率和填充值的H′明显高于杂交选育的种质资源，同时，这6个指标的平均H′和物理特性指标分值H′亦高于杂交选育的种质资源，表明国内地方种质资源物理特性遗传多样性比杂交选育种质资源物理特性的遗传多样性丰富，在品种选育或改良中具有较好应用前景。

表4 国内地方和杂交选育种质资源物理特性的遗传多样性Tab.4 Genetic diversity of physical characteristics of domestic local germplasm resources and hybrid breeding germplasm resources

2.4 参试种质资源物理特性指标聚类分析

利用R语言软件对269份烤烟种质资源6个物理特性指标进行层次聚类，在相似距离0.982处，可将参试种质资源聚为4个类群（图2），Ⅰ类群包括053、034等73份种质资源，Ⅱ类群包括222、264等70份资种质源，Ⅲ类群包括114、248等94份种质资源，Ⅳ类群包括168、173等32份种质资源，各类群种质资源物理特性主要参数见表5。从表5可见，类群间6个聚类指标和二级统计指标物理特性分值的差异达极显著水平。从物理特性指标适宜性来看，4个类群种质资源的平衡含水率均在最适宜范围，其他指标的适宜性在类群间存在差异，Ⅰ类群叶面密度、单叶质量、拉力、含梗率适宜，填充值次适宜。Ⅱ类群拉力最适宜，叶面密度、单叶质量适宜，含梗率、填充值次适宜。Ⅲ类群单叶质量、拉力、含梗率适宜，叶面密度和填充值不适宜。Ⅳ类群拉力最适宜，含梗率适宜，叶面密度次适宜，单叶质量、填充值不适宜。

表5 不同类群种质资源物理特性指标的差异分析Tab.5 Difference analysis of physical characteristic indexes of germplasm resources in various groups

物理特性分值是衡量烟叶物理特性好坏的重要指标，分值越大，烟叶物理特性越好［22]。Ⅰ类群、Ⅱ类群种质资源物理特性分值高于Ⅲ类群、Ⅳ类群，表明Ⅰ类群、Ⅱ类群种质资源的物理特性优于Ⅲ类群、Ⅳ类群。对物理特性具体指标而言，含梗率越低越好，平衡含水率和填充值越大越好，叶面密度、单叶质量和拉力均在适宜性范围内，烟叶物理特性指标间存在复杂的相互关系。因此，在评价烤烟种质资源物理特性时，除物理特性分值外，各指标的适宜性也应给予关注。进一步分析表明，269份参试种质资源中，92份种质资源物理特性分值达80分以上，其聚在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ类群的种质资源数分别为33份、47份、8份和4份，其中12份物理特性分值90分以上的种质资源聚在Ⅰ类群（7份）和Ⅱ类群（5份），这12份种质资源的主要物理特性参数见表6。福泉厚节巴和薄荷烟的叶面密度、金黄柳的单叶质量、索马里2号的含梗率次适宜，日本烤烟2的含梗率不适宜，这5份种质资源物理特性分值高，但个别指标适宜性存在欠缺。丰字6号、黄苗榆、B22、革新6号、牡单81-56、黑玉米棒子和凤城黄金等7份种质资源物理特性分值高，6个指标均在最适宜或适宜范围，这7份物理特性优异的种质资源可在品种选育或物理特性改良中根据育种目标选择利用。

表6 12份烤烟种质资源的物理特性指标比较Tab.6 Analysis of physical characteristic indexes of 12 flue-cured tobacco germplasm resources

3 讨论

269份参试种质资源物理特性指标频率分布和适宜性分布表明，平衡含水率优异的种质资源丰富，填充值、叶面密度优异的种质资源相对匮乏，单叶质量、拉力、含梗率优异的种质资源较丰富，在烤烟种质资源研究中，应加强填充值和叶面密度优异的种质资源的收集鉴定。参试种质资源6个物理特性指标变异系数6.73%～20.25%，遗传多样性指数1.934～2.050、平均2.014，遗传多样性较丰富。同时，烟叶平衡含水率变异系数最低（小于10%），这与刘阳等［20]和李瑞丽等［24]研究结果一致。但有关平衡含水率变异系数低的原因还有待进一步研究。

遗传多样性通常指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和，种内遗传变异越丰富，对环境的适应能力越强，其物种进化的潜力越大。本试验中国内种质资源物理特性遗传多样性比国外资源稍丰富，国内地方种质资源物理特性遗传多样性比杂交选育种质资源丰富。国内种质资源物理特性遗传多样性比国外资源稍丰富的原因，可能与烟草传入我国后不同生态环境的长期驯化和非目标多样化选择等有关。烟草传入我国已有400多年，在长期的种植过程中，资源间的天然杂交、自然突变，以及不同种植区域农民根据自己需求（如抗逆性好）进行了选择等，这种长期的环境驯化和非目标多样化选择丰富了国内种质资源的遗传多样性。国内地方种质资源物理特性遗传多样性比杂交选育种质资源丰富的原因，与长期人为定向选择和保守的育种策略有关。烟草作为特殊的叶用经济作物，围绕“优质、抗病”进行育种选择，长期的人为定向选择导致烟草育种过度依赖骨干亲本，且亲本种质资源遗传背景狭窄［25-26]，进而导致杂交选育品种遗传多样性降低。美国烟草育种也存在类似情况，为通过最低育种标准，烟草新品种选育基本是核心种质间的杂交，美国20世纪40年代以前的37个农家品种遗传相似系数为0.758，20世纪90年代和21世纪前10年育成品种的遗传相似系数分别为0.849和0.874，与农家品种相比，杂交选育品种遗传多样性变低，遗传基础变窄［27]。可见，长期的人为定向选择和保守的育种策略是导致杂交选育品种（或种质资源）遗传多样性降低的主要原因。

烤烟物理特性受烟区生态环境［11-12]和烘烤过程［28]的影响，对本试验中7份烤烟物理特性优异种质资源进行选择利用时，要综合分析烟区生态环境、烤房类型及烘烤工艺等与本试验条件的相似性，必要时可对其在当地的物理特性表现进行验证后再选择利用。因此参试种质资源在不同生态区域和不同烘烤条件下的物理特性的差异还有待进一步研究。

4 结论

269份烤烟种质资源物理特性遗传多样性较丰富，平衡含水率指标优异的种质资源丰富，填充值和叶面密度指标优异的种质资源相对匮乏，单叶质量、拉力和含梗率指标优异的种质资源较丰富。国内种质资源物理特性遗传多样性比国外种质资源稍丰富，国内地方种质资源物理特性遗传多样性比杂交选育种质资源丰富。丰字6号、黄苗榆、B22、革新6号、牡单81-56、黑玉米棒子和凤城黄金等7份烤烟物理特性指标优异的种质资源可供品种选育或物理特性改良时加以利用。