稻花香馫香型白酒酒曲酶活测定与高通量测序分析

崔雨欣，蔡开云，陈 萍，申登晋，曾宇伦，谭光迅，赵述淼

（1.华中农业大学生命科学技术学院，农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070；2.湖北稻花香酒业股份有限公司，湖北宜昌 443100）

大曲是传统固态白酒酿造的物质基础。大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经粉碎、加水混捏、压成曲醅并在人为控制的一定温度和湿度条件下形成大小不一的块状物。作为糖化发酵剂，大曲含有丰富的微生物群落、功能酶系及在制曲过程中形成的风味前体物质，是白酒质量和产量的重要保障[1-2]。在大曲的制作过程中温度是一项重要的指标，根据品温的不同，大曲可分为低温大曲、中温大曲、中高温大曲和高温大曲。小曲是用米粉、米糠或麸皮，有的添加中草药或观音土，接入定量的母曲，在一定温湿度条件下制成的[3]。小曲作为同样重要的糖化发酵剂，是小曲白酒香气的主要来源。根霉曲实质上是纯种小曲[4]，将纯种根霉菌和酵母菌分开培养并按一定比例混合制成酿酒所用根霉曲，从而使小曲的质量显著提高[5]。在糖化阶段根霉曲按一定比例与蒸泡摊晾后的原料混合并加入，促进糖化的顺利进行，具有出酒率高，酒质稳定的优点。

馫香型白酒是湖北稻花香酒业股份有限公司开发一种创新型酒体。它的酿造工艺包括糖化培菌、高温堆积、入窖发酵等过程，有效地结合了小曲清香型白酒的糖化培菌，酱香型白酒的高温堆积以及浓香型白酒泥窖发酵的工艺特点，进而形成了独特的馫香型白酒生产工艺，具体为：蒸煮后的高粱加小曲进行培菌糖化，随后糖化好的酒醅配糟后加入高温大曲进行高温堆积，最后堆积好的酒醅加入中高温大曲，进入泥窖开始发酵（图1）。目前尚不清楚稻花香馫香型白酒酿造使用的3 种曲——根霉曲、中高温大曲和高温大曲的酶活力和微生物数量及组成，本研究测定了它们的酶活力和微生物数量，并进行了高通量测序，为馫香型白酒的生产及工艺改造提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：取自稻花香酒业生产的根霉曲（GM）、中高温大曲（ZGW）和高温大曲（GW），每种酒曲取3个批次。

培养基：孟加拉红培养基和LB培养基。

1.2 理化性能的测定

酯化力、糖化力、液化力和酸性蛋白酶活力的测定均参照沈怡方《白酒生产技术全书》[6]所示的方法。

1.3 微生物数量的检测

本实验采用传统的稀释平板涂布法测定酒曲中的微生物数量。利用孟加拉红培养基计数酵母菌和霉菌，利用LB 培养基计数细菌和芽孢杆菌。其中计数芽孢杆菌时先将稀释好的样品液置于80 ℃水浴15 min后再进行涂布[7]。

1.4 高通量测序

将3 种酒曲样品提取DNA 并进行高通量测序（美吉测序公司，上海），OTU[8]（Operational Taxonomy Unit）分析、Alpha 多样性分析[9]及物种注释均通过美吉生物科技有限公司云平台进行（https://cloud.majorbio.com/），试验数据利用SPSS21.0 统计软件进行单因素方差分析和差异显著性检验，以P＜0.05为差异显著水平，标注各组差异性。

2 结果与分析

2.1 理化性质

根霉曲、中高温大曲和高温大曲的各项理化性质见表1。

表1 不同工艺曲理化指标

由表1 可知，3 种曲的糖化力具有明显差异，中高温大曲糖化力最高；根霉曲的液化力、酸性蛋白酶活力和酯化力最高，与其他两种曲差异性显著，分别达16.36 U/g、189.32 U/g和164.69 mg/g。

2.2 微生物计数

采用传统的稀释平板涂布法对酒曲中的霉菌、酵母菌、细菌和芽孢杆菌进行计数，结果见表2。

表2 3种曲中不同种类微生物数量

计数结果表明，高温大曲和中高温大曲的酵母菌数量差异不显著，而根霉曲中没有检测到酵母；中高温大曲和根霉曲的霉菌数量显著高于高温大曲，超出一个数量级；中高温大曲芽孢杆菌显著高于高温大曲，总细菌无显著差异，而根霉曲中未检测到细菌和芽孢杆菌。

2.3 高通量测序结果

2.3.1 样品多样性

对稻花香馫香型白酒酒曲样品的细菌和真菌群落进行高通量测序分析，结果见表3。由表3 可知，中高温大曲和高温大曲细菌的Shannon 指数都大于1，与根霉曲有显著差异。而3 种曲真菌群落的Shannon 指数都具有明显差异性，其中中高温大曲的Shannon指数最高。

表3 细菌和真菌群落的Shannon指数表

2.3.2 高通量测序分析微生物群落组成

在门水平和属水平上分别计算了各样本的细菌群落的物种平均相对丰度（n=3），如图2 所示。（1）高温大曲（GW）在门水平上的优势菌群（平均相对丰度＞1%）包括Firmicutes（厚壁菌门，50.13%），Proreobacteria（变形菌门，33.13%）和Actinobacteria（放线菌门，15.84%）；在属水平上有Bacillus（芽孢杆菌属，32 %），Kroppenstedtia（21.6 %），Saccharopolyspora（糖多孢菌属，18.06 %），Thermoactinomyces（高 温 放 线 菌 属，9.01 % ），Norank_f_Pseudonocardiaceae（4.93 %），Planifilum（3.4 %），Staphylococcus（葡萄球菌属，3.13 %）和Pediococcus（片球菌属，1.75 %）。（2）中高温大曲（ZGW）在门水平上的优势菌群有Firmicutes（厚壁菌门，50.76%），Proteobacteria（变形菌门，21.21%）和Actinobacteria（放线菌门，14.81%）；在属水平上有Bacillus（芽孢杆菌属，17.96 %），Kroppenstedtia（16.23 %），Thermoactinomyces（高温放线菌属，8.73%），Weissella（魏斯氏菌属，5.48%），Lactobacillus（乳杆菌属，3.8 %），Pediococcus（片球菌属，2.46 %），Planifilum（1.96 %）和Staphylococcus（葡萄球菌属，1.69%）。（3）根霉曲在目水平未分类。

图2 样品门水平（A）和属水平（B）的细菌丰度比例图

在门水平和属水平上分别计算了各样本的真菌群落的物种平均相对丰度（n=3），如图3 所示。（1）高温曲（GW）在门水平上的优势菌群（平均相对丰度＞1 %）为Ascomycota（子囊菌门，99.86 %），在属水平上有Thermomyces（嗜热真菌属，79.49 %），Thermoascus（嗜热子囊菌属，13.98 %），Aspergillus（曲霉菌属，1.91 %）。（2）中高温大曲（ZGW）在门水平上的优势菌群有Ascomycota（子囊门，86.27%），Mucoromycota（毛霉门，5.46%）和Basidiomycota（担子菌门，8.19 %）；在属水平上有Thermoascus（嗜热子囊菌属，62.72 %），Thermomy-ces（嗜热真菌属，4.53 %），Cutaneotrichosporon（5.56%），Candida（假丝酵母属，3.53%），Rhizopus（根霉菌属，5.36 %），Aspergillus（曲霉菌属，3.04 %），Hyphopichia（2.29 %），Trichomonascus（2.29 %）和Xeromyces（耐干霉菌属，1.89 %）。（3）Rhizopus（根霉菌）作为根霉曲中的优势菌种，丰度达99.99%。

图3 样品门水平（A）和属水平（B）真菌丰度比例图

2.4 物种Venn图

Venn 图能够得到不同样品之间相同的物种组成，3 种曲的Venn 图分析如图4 所示。3 种曲共有的细菌属有25 种，中高温大曲和高温大曲共有的细菌属有185 种，中高温大曲和高温大曲分别与根霉曲的物种重合有37 和26 种。其中，中高温大曲物种最为丰富，达591 种，高温大曲210 种，而根霉曲只有41 种。3 种曲共有的真菌属有4 种，中高温大曲和高温大曲共有39 种。其中物种最多的是中高温大曲96 种，而高温大曲和根霉曲分别只有49种和5种。

图4 样品属水平细菌（A）和真菌（B）venn图

3 讨论

作为白酒酿造过程中起重要作用的液化酶和糖化酶，直接影响着原料中淀粉的转化效率及出酒率。酸性蛋白酶可以分解原料中的大分子蛋白，为微生物生长提供氮源，促进发酵[10-12]。酯化力是大曲自身经发酵成熟后固有的催化醇和羧酸生成酯的能力，而生成的酯是浓（酱）香型白酒重要的主体香味物质[13]。本研究发现，中高温大曲的糖化力更高；根霉曲的酸性蛋白酶活和酯化力大于高温大曲和中高温大曲。因此3 种曲在稻花香馫香型白酒酿造的不同阶段加入，不仅有利于提高出酒率，还有利于馫香型香气的形成。

大曲微生物代谢产生的乙醇和各种风味物质，是白酒的关键组分。本研究首先使用平板计数测定微生物数量，结果表明，中高温大曲的霉菌、酵母菌、芽孢杆菌以及总细菌数量高于高温大曲。微生物计数虽然对微生物进行了绝对定量，并侧面反映了大曲中微生物的生长趋势，但由于仅仅反映的是可培养微生物，且受环境中的温度、湿度和气候等因素影响很大,因此，对大曲微生物的认识存在很大的局限性。本研究针对上述问题，通过高通量测序技术分析了稻花香馫香白酒3 种酒曲微生物群落多样性及组成。在测定的3 种酒曲中，根霉曲的Shannon 指数最小，其中根霉菌的相对丰度达99.99 %，而中高温大曲相比高温大曲和根霉曲而言，其细菌和真菌群落的Shannon 指数更高，具有更高的物种丰富度和均匀度，并且在属水平上拥有近600 种细菌，真菌也有将近100 种。这可能是由于高温大曲的品温过高，引起不耐高温微生物在制曲过程中死亡；而根霉曲采用的是纯种制曲，基本以根霉菌为主，也包括极少量来自环境及工具的细菌。

制曲温度影响着大曲微生物群落结构的组成。本研究发现，中高温大曲和高温大曲细菌群落都由Bacillus（芽孢杆菌属）占主导地位，丰度分别为17.96%和32%，侧面印证了传统稀释涂平板法中芽孢杆菌占总细菌的绝大多数的结果。同时还发现中高温大曲的细菌相较于高温大曲而言，Thermoactinomyces（高温放线菌属）和Bacillus（芽孢杆菌属）明显下降。芽孢杆菌产多种蛋白酶，是大曲中风味物质的主要来源。高温放线菌属常见于自然界高温场所，具备耐高温特性，适应大曲发酵中的高温环境，具备开发高温淀粉酶、蛋白酶、酯酶、脱氢酶和多酚氧化酶等潜力[14]。在真菌群落组成中，Thermomyces（嗜热真菌属）在高温大曲的相对丰度远高于中高温大曲（4.53 %），达79.49 %。而Thermoascus（嗜热子囊菌属）作为中高温大曲中占主导地位的真菌属，相对丰度达62.72%，远高于高温大曲中的丰度（13.98%）。嗜热真菌属产木聚糖酶和蛋白酶等酶类，李欣等[15]发现嗜热真菌属是酒醅发酵过程中产酶的主要功能菌。嗜热子囊菌产纤维素酶和蛋白酶，可降解糖类和蛋白质等并具有良好的热稳定性,有利于大曲产酒生香作用[16]。两种大曲拥有不同的微生物群落组成，可能是由于不同的制曲温度引起的：高温大曲培菌温度在63～68 ℃之间，中高温大曲培菌温度在55～60 ℃之间。根霉曲中，根霉菌产糖化酶、液化酶、蛋白酶和脂肪酶，还能产生各种有机酸，可为其他微生物的代谢提供基础物质，对整个糖化发酵过程以及白酒的风味都具有一定影响。

本研究系统性地检测分析了稻花香酒厂用于馫香型白酒酿造的3 种曲（中高温大曲、高温大曲和根霉曲）中微生物的群落结构，同时对曲样的酶学指标进行测定，简单分析了酒曲中细菌真菌数量及群落结构的差异和酶活力之间的关系，为优化稻花香酒曲工艺、提高酒曲质量提供了参考依据，具有理论和实践意义。