借助机器视觉进行电化学发光检测的开放实验设计及教学探讨

刘 根，王培龙，高 慧

(淮北师范大学 化学与材料科学学院，安徽 淮北 235000)

化学专业实验作为化学理论课的重要支撑，是理论应用于实践的重要环节，目的在于培养学生严谨的科学态度，提高学生分析解决问题的能力以及主动实践能力[1]。开放实验作为高等院校实验课程的重要补充部分，往往能够激发学生学习兴趣，提高学生探索求知的能动性。就化学类开放实验而言，往往承载提升学生实验操作能力，培养学生独立思考和设计实验等科研素质的重大任务[2-3]。

机器视觉就是用机器代替人眼来做测量和判断。机器视觉系统是指通过机器视觉产品(工业相机或科研相机)将被摄取目标转换成图像信号，传送给专用的图像处理系统，根据像素分布和亮度、颜色等信息，转变成数字化信号；图像系统提取相关信息后进行分析应用[4-5]。

电致化学发光(ECL)是指通过施加一定的电压在电极的表面产生电生物质，这些物质彼此之间或与体系中某些组分(共反应剂)之间以电子传递的方式形成激发态，激发态的物质返回基态释放能量的同时产生发光现象[6-8]。电致化学发光是化学发光与电化学技术相结合的一种分析方法，它在继承二者的优点的同时还具有独特的优势。医院对癌症标志物进行免疫检测，利用的就是在ECL罗氏技术，因为电致化学发光无需激发光源从而避免了外加光的干扰，并且由于检测信号为光信号，这就排除了电化学反应中电的干扰，具有接近于零的背景信号，提高了信噪比，从而具有高的选择性、灵敏度[9-10]。关于电化学分析和光学分析的理论知识，大学生已在“仪器分析”课程中学习，但在大学生的基础实验中，很少有两种方法相结合的分析检测试验。

在分析化学类专业中，开设机器视觉电化学发光检测的开放实验，将电化学和光学的理论知识与具体的实验相结合，使学生深刻了解电化学发光的工作原理、材料的制备方法和ECL检测过程。引导学生搜索、分析、筛选相关材料，自主设计电化学发光检测平台，进行实验并根据实验结果得出相关结论。实验过程中，不仅可以让学生掌握现代仪器分析的专业知识，了解电化学发光领域的研究热点，还可以让学生在实验过程中具体学习到纳米材料制备、表征及性能测试的方法，培养学生查阅文献和论文写作等方面能力。

本开放实验适用于材料化学类，应用化学类和化学师范类本科生，学生应当了解当前ECL技术和光学成像技术的研究进展，熟悉ECL成像在现代分析化学领域的应用。参与实验的学生要掌握常见ECL探针的制备方法，能够独立设计简单的纳米材料并进行实验室合成。机器视觉电化学发光检测开放实验的开设，能够让学生学会设计可视化ECL平台，同时了解材料表征的常见方法，从而提高学生自主思考、自行设计实验和分析解决问题的能力。

一、实验具体教学要求

实验教学要求具体有以下几点：第一，了解电化学发光的工作原理、发展历史及现阶段研究趋势；第二，掌握常见材料的合成方法和目标物检测方式。学生通过收集相关文献，讨论并初步制定实验方案和相关实验步骤；第三，教师对学生的方案进行研判，指导学生优化方案，提高实验的可行性；第四，了解扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)等常规测试仪器的工作原理和用途，通过对所合成的材料进行表征，学生能够对材料的品质进行描述和评判，进一步培养学生解决实际问题的能力；第五，待测物质造成ECL信号的变化，从而实现对待测物质的定性和定量分析。该过程中，训练学生自身的仪器操作能力，学以致用，获得合理的实验结果，提高学生对数据的分析能力。

二、开放实验内容

(一)生物酶功能化的大金球的合成

1 M H2SO4加入5g/L Na3Au(SO3)2溶液中，反应十分钟，大尺寸金球颗粒形成并沉淀到试管底部。然后，用二次去离子水反复洗涤沉淀物。紧接着，在37℃的温度下，金球颗粒、磷脂酶D(PLD，5 U/mL)和葡萄糖氧化酶(COD，2 U/mL)一起孵育24小时。在Au-S的作用下，PLD和COD自组装到金球表面。最后，使用二次去离子水对生物酶功能化的金球进行彻底冲洗，除去没有吸附到金球上的PLD和COD。

图1 金球的SEM图(A)和TEM图(B)

(二)材料表征

利用SEM和TEM对金球的形貌和性能进行表征。图1(A)和(B)分别是金球的SEM和TEM图，很容易看出，金球大小不一，尺寸分布在100 nm～2μm之间，而且金球表面粗糙，这表明本方法合成的金球有效表面积较大以及催化活性位点较多。通过SEM和TEM测试，使学生掌握表征材料形貌的方法，在实验中提高了学生分析和评价材料性能的能力。

(三)机器视觉下磷脂酰胆碱的检测

在含有发光剂L012和待测物磷脂酰胆碱(PdtCho)的溶液中，施加一定电压，进行ECL图像采集。学生在分析成像数据后，发现金球在发光时存在个体性差异，但金球群体的发光强度满足统计学规律。如图2(A)所示，金球在ECL场中基本上都发光，但发光强度不均一，如图2(B)，发光强度在116.3 a.u.左右浮动。进一步考察平均ECL强度与金球数目的关系，发现随着金球数目增多，平均ECL强度趋于稳定，30个及以上数目金球的平均ECL强度十分相近。因此，本实验至少采集30个金球的平均ECL信号作为检测信号。

图2 在含有L012和PdtCho溶液中的金球的ECL图(A)和ECL强度的表面3D伪彩图(B)

优化条件之后，对不同浓度的PdtCho进行检测。检测原理如下，金球表面吸附有PLD和COD，两种酶协同催化PdtCho产生H2O2，H2O2又是ECL试剂L012的共反应剂。因此，PdtCho浓度越大，金球表面产生的H2O2就越多，收集到ECL信号就越强，据此可以建立待测物PdtCho的浓度与ECL强度的关系，从而实现对PdtCho的检测。本实验中，随着PdtCho浓度增加，30个金球的平均ECL强度增加，并且在0.5～10mM的浓度范围内满足一定的线性关系，线性方程为I=20.23C+16.04，r=0.9916，检出限为0.05mM。同学们通过ECL成像实验获得单个金球的ECL图像，通过观察和讨论，发现金球发光的个体性差异和统计学规律，提高了学生自身的归纳总结的能力。对PdtCho进行定量分析，进一步验证这种统计学规律的有效性，同时建立ECL成像检测PdtCho的新方法。此过程有助于提高学生发现问题，分析问题，解决问题的能力。

三、讨论和思考

实验结束后，需讨论、思考以下几个问题：

问题一：常见的ECL试剂有哪些？为什么选择L012作为成像试剂？

通过调研国内外文献，学生发现大多数ECL实验利用的是含有共反应剂ECL体系。该体系反应过程涉及到电生物质的产生、均相化学反应的发生、激发态的形成以及激发态衰减时的光辐射等。其中，以三联吡啶钌-三丙胺和鲁米诺-过氧化氢的ECL体系最为经典。近十年来，以量子点、类石墨相氮化碳和钙钛矿材料为代表ECL体系也得到了很大发展。L012是鲁米诺的衍生物，具有鲁米诺相似的发光特性，但其发光强度是鲁米诺的100倍，且L012的生物毒性较低，有利于生物酶催化活性的保持，所以本实验选择L012作为成像试剂。

问题二：H2SO4和Na3Au(SO3)2的化学反应方程式可能是什么？

Na3Au(SO3)2是非氰化学镀领域的重要金源，学生通过分析试剂商提供的《化学品安全技术说明书》，得知Na3Au(SO3)2在强酸溶液中容易生成SO2和单质金。所以可能的化学反应为：2[Au(SO3)2]3-+4H+==2Au+3SO2+SO42-+2H2O

问题三：金球在成像过程中起到什么作用？

学生对这一问题进行分组讨论，他们归纳了各种尺寸的金球的合成方法。根据文献得知，纳米级的金球比较常见，但大小普遍在100nm以下；大尺寸金球比较难以合成，微米级金球更是少见。由于本实验是光学显微成像，阿贝衍射极限要求金球的尺寸必须在200nm以上，而想获得空间可分辨的成像效果，学生们选择合成微米级金球。由于PLD和COD含有巯基，很容易形成Au-S键，使生物酶负载到金球上，这样金球就成为ECL反应的场所。

问题四：如何提高ECL强度？

增敏ECL的方法很多，和老师交流之后，学生了解到可以考虑电极表面“内壳层”和“外壳层”催化的两种形式。对于鲁米诺-过氧化氢体系而言，重点是提高反应过程中活性氧的产量，可以使用二茂铁这样的电生催化剂，也可以使用血红素、碳纳米管这样的可以修饰到电极表面的催化剂。

问题五：如果不采用大量金球的平均ECL强度，而是使用单个金球的ECL强度作为检测信号，对检测结果将会产生什么样的影响？

学生在明场和ECL场中考察了200个金球的成像情况，10个和20个金球的平均ECL强度相对较大，30个，50个，100个和200个金球的平均ECL强度十分相近，相对标准偏差低于10%。如果只收集单个金球的ECL信号，异质性使得规律性不明显，低浓度PdtCho的ECL强度有可能小于、等于甚至大于高浓度PdtCho的ECL强度。依靠单个金球建立准确的线性关系是非常困难的。

四、教学探讨

开放实验要求学生掌握和了解相关专业知识，理论与实践相结合，拓宽学生的视野。适当增加实验的难度，一方面增加学生对科研的兴趣，另一方面让学生深入参与探索求知的过程，积极发挥主观能动性和创造力。

该实验中，学生将机械视觉和材料科学相结合，借助于机器视觉对材料的发光情况进行分析，学生对一些现象进行归纳总结，建立起对磷脂酰胆碱的检测的新方法。

但在开放实验过程中，也存在一些问题：

第一，机器视觉检测是分析化学中新兴的检测手段，大学教材中并未涉及，大学生缺乏对一些前沿的专业知识的了解。大学生调研文献存在一定的盲目性，在设计实验方案时，创新性明显，但可行性较差。

第二，大多数学生的实验记录不够规范，有些重要的实验细节被忽略，在分析问题时缺乏可参考的实验数据。

第三，在操作过程中，有些学生缺乏耐性，急于求成，获得的实验结果不理想。使用仪器时，对仪器的保护意识淡薄，存在超限使用的问题。

第四、机器视觉检测的化学原理基本明确，但相关的视觉软件代码编写存在困难，需要加强计算机相关技能学习，实现多学科知识的综合应用。

因此，在日后实验过程中，指导老师应当加强对专业性较强的理论知识的讲授，引导学生关注前沿课题，抓住关键问题，设计出既有理论支持，又切合实际的实验方案。发现问题，分析问题，解决问题是一个连贯性过程，实验过程中每一个细节都有可能影响问题的分析与解决。因此，有必要要求学生认真做好实验记录，指导老师也要定时检查学生的实验数据，及时帮助学生分析问题，参与相关讨论。分析化学讲究的是“慢工出细活”，浮躁的情绪往往会影响实验结果，学生在实验过程中应该懂得自我调整，加强科研素质的培养。