潮汕特色佛手香黄的特征挥发性风味成分分析

林良静，蔡惠钿,2，包涵，黄雪盈，陈曦，高向阳,2

（1.华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性物重点实验室，广东广州 510642）（2.华农(潮州)食品研究院有限公司，广东潮州 521000）（3.广西生态工程职业技术学院旅游与交通管理学院，广西柳州，545004）

佛手柑是芸香科（Rutaceae）柑桔属（Citrus）常绿小乔木植物的果实[1]，因其独特芳香而备受欢迎[2,3]，其香气主要来自于其萜烯类、倍半萜烯类以及高级醇类、醛类、酮类、酯类等物质[4]。佛手柑作为药食两用的药材，本身辛辣苦涩不适宜服用。潮汕地区流行通过盐腌、冲洗、晒干、炊熟、浸糖液、浸中药粉液、烘干等复杂工艺将佛手柑制成佛手香黄。经炮制后的佛手香黄具有去积祛风、开胃理气、化痰生津的功效，且风味浓郁香甜、醇厚陈香[5]。目前对佛手香黄的挥发性风味成分仅有严赞开[6]等采用GC-MS分析发现储存阶段的佛手香黄(Z)-2,3-丁二醇、(E)-2,3-丁二醇的含量明显增加，但对其核心特殊香气成分鲜有研究报道。

食品的风味和香气通常与挥发性物质相关，并且是评估消费者对食品的接受或拒绝以及感官上的偏爱的重要因素[7]。挥发性物质对食品香气的最终贡献不仅取决于其浓度，还取决于其气味阈值。单一地考虑含量而忽略阈值对挥发性进行判断不够全面。目前，检测挥发性物质的常用手段是GC-MS，但GC-MS技术通常检测分子量较大（C9～C21）的物质，无法检测到分子量较小（C5～C10）但至关重要的微量风味物质。近年来，GC-IMS作为挥发性风味检测手段逐渐普及，可快速、简便以及可检测到分子量较小的微量物质（C5～C10），已成功运用在多种食品挥发性风味分析和品质检测上[8]。香味活度值（OAV，Odoractivevalue）是评估挥发性风味对风味贡献值的重要参数，当OAV＞1时往往认定其对挥发性风味贡献较大。但是OAV值计算涉及数种物质的定量工作，工作量较大。刘登勇等[9]将百分比引进OAV计算公式中得到新参数ROAV，通过新公式可快速计算得到了皋火腿的主要贡献风味物质。樊艳等利用SPME-GC-MS结合ROAV分析腐乳中的主体风味物质[10]。

因此本文采用气相色谱-离子迁移色谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）及相对香气活度值（ROAV）计算对佛手香黄挥发性物质进行研究，再通过化学计量对不同品牌的佛手香黄的挥发性物质进行区分识别，确定特殊香气的特征性标志成分，为提供建立佛手香黄质量标准提供分析检测的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

佛手香黄样品在潮汕地区的生产企业和市场收集，为排除各品牌配方不同以及不同储存时间所带来的风味差异，选择了4个不同品牌以及不同储存时间共8种有代表性的样品。具体信息如下：

1-1：品牌1，储存3年份潮州老香黄；2-1：品牌2，储存1年份潮州老香黄；2-2：品牌2，储存2年份潮州老香黄；2-3：品牌2，储存3年份潮州老香黄；3-1：品牌3，储存1年份潮州老香黄；3-2：品牌3，储存2年份潮州老香黄；3-3：品牌3，储存3年份潮州老香黄；3-4：品牌3，储存4年份潮州老香黄。

FlavourSpec®Laboratory 风味分析仪配有GC×IMS Library Search软件，德国G.A.S公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GC-IMS实验方法

1.2.1.1 样品的前处理

称取样品各1 g置于20 mL顶空瓶中，60 ℃孵育15 min后进样，用气相离子迁移谱仪FlavourSpec®进行GC-IMS分析。

1.2.1.2 GC-IMS条件

色谱柱FS-SE-54-CB-1（15 m，ID：0.53 mm）（美国Restek公司）柱温60 ℃，载气/漂移气N2，IMS温度45 ℃，孵育时间15 min，孵育温度60 ℃，进样针温度65 ℃，孵化转速500 r/min进样量500 μL，分析时间30 min。

E1（漂移气流速）150 mL/min；E2（气象载气流速）0～2 min，2 mL/min；2～20 min，2 mL/min；20～30 min，100 mL/min；30 min，100 mL/min。

1.2.2 相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）

该参数设定对样品风味贡献最大成分：ROAVstan=100，其他的成分（A）：

式中：C% A、TA为各风味组分的相对百分含量和对应的感觉阈值；C% stan、Tstan分别为对样品风味贡献最大组分的相对百分含量和感觉阈值。当物质的ROAV＞1时，该物质对于挥发性风味的贡献大，为主香成分，ROAV越大，对风味的贡献就越大。当0.1＜ROAV＜1时，该成分作为修饰成分。

1.3 数据处理

使用G.A.S.开发的GCxIMS Library Search软件，通过内置的NIST 2014气相保留指数数据库与G.A.S.的IMS迁移时间数据库二维定性，软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析；利用LAV软件的Gallery Plot插件选取图中所有的待分析区域，生成指纹图谱；SIMCA-P 14.1进行主成分分析和PLS-DA建模；用IBM SPSS 25.0、Excel软件和Origin 2018 64Bit进行数据处理及作图。

2 结果与分析

2.1 挥发性成分定性及定量分析

使用G.A.S开发的GCxIMS Library Search软件，通过内置的NIST 2014气相保留指数数据库与G.A.S.的IMS迁移时间数据库二维定性和定量分析，得到Gallery Plot图，如图1。

图1 气相离子迁移谱图中选取的挥发性有机物的Gallery Plot图Fig.1 Gallery plot diagram of volatile organic compounds selected from gas phase ion migration spectrum

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图1 中每一列为同一保留时间及漂移时间下的有机物（不同样品中相同的物质）的信号峰；其色块颜色越白，峰强越强，含量越高。从3个品牌的佛手香黄中检测到8种酯类、15种醛类、11种醇类、3种酮类、23种烯萜类、6种酸类、3种呋喃类、1种噻唑类和1种吡嗪类。将70种已知挥发性风味化合物归类，利用面积归一法计算各挥发性成分的相对百分含量并统计如表1。

表1 佛手香黄的挥发性物质相对百分含量Table 1 The relative content of volatile flavor substances in Lao-Xiang-Huang preserved

将各类挥发性化合物汇总并进行单因素分析及显著性差异分析，绘制柱形图，如图2。

图2 基于GC-IMS分析佛手香黄的不同种类挥发性物质相对百分比柱形图Fig.2 The relative percentages bar diagram of the volatile organic compounds in Lao-Xiang-Huang preserved were detected by GC-IMS

不同品牌不同储藏时间的佛手香黄样品中萜烯类种类丰富，与其他物质相比，相对百分含量均最高，约50%～70%。不同品牌的佛手香黄的烯萜类物质有差异，品牌2的烯萜类物质显著高于其他品牌。佛手香黄在储藏前3年，烯萜类相对百分比含量变化不显著，第3年样品烯萜类物质显著减少。烯萜类物质一般来自植物自身，具有花草的香味。生佛手的烯萜类物质在蒸制过程损失严重[11]，且腌制放置过程中持续下降[6]。柠檬烯是新鲜佛手的标志物质，占比约30%～50%[12]，腌制后的潮州老香黄中的柠檬烯损失严重，仅相对百分含量8%～10%。其次，相对百分含量较高的香叶醇、alpha-松油醇-M、alpha-松油醇-D均在腌制佛手中被报道[13]，为花香味特征[14]。

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醇类物质主要由氨基酸的脱羧和脱氨产生，具有清凉的感受[15]，有研究表明在储存期间醇类物质会显著增加，且成为佛手香黄储存过程香味增浓的主要原因[16]。本研究中醇类物质相对含量随时间变化并不显著，但不同品牌间醇类含量有显著差异，品牌2的佛手香黄的3-甲基丁醇、1-戊醇、甲醇、1-苯乙醇均高于其余两者。与醇类的结果类似，醛类物质相对含量随时间变化不显著，品牌2的醛类相对百分含量显著高于其余两者。醛类有强烈香味，香味一般似果香，味甜带涩[17]。其含量较高的是丙醛，表现出青草、可可和咖啡味[18]。

酯类物质主要来源于脂肪酸氧化、氨基酸代谢及醇和醛等代谢合成，通常带有水果的香气[19]。品牌2的酯类物质显著高于其他品牌，并且随着储藏时间的增加，酯类物质相对百分含量增加。本文检测的酯类中含量最高的是乙酸香叶酯和乙酸乙酯。乙酸香叶酯具有玫瑰和薰衣草的香气，是一种重要的香料来源[20]。乙酸乙酯能产生令人愉悦的水果香气[21]。其余的呋喃、酸类、吡嗪类物质相对百分含量较低。

2.2 基于ROAV计算分析佛手香黄的主要挥发性风味变化

对检测结果中风味成分的在水中的香味阈值进行查询并计算，定义对样品香味贡献最大的成分3-甲硫基丙醛ROAV为100，其他风味成分的ROAV由式（1）计算得出，得表2。

表2 佛手香黄挥发性风味成分的相对风味活度值Table 2 The relative odor activity value of volatile flavor components in Lao-Xiang-Huang preserved

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通常，具有较高ROAV（大于1）的香气化合物被认为是总体香气的主要贡献者，0.1＜ROAV＜1的成分被认为在总体香气中起协调作用[49]。

与陈小爱等人利用GC-IMS分析潮州佛手香黄的挥发性物质的结果不同，本研究利用GC-IMS结合ROAV分析8个佛手香黄样品中相对香气值最高的均为甲硫基丙醛[50]。甲硫基丙醛（0.09%～0.27%）相对含量虽不高，但由于其低阈值，对佛手香黄风味贡献最大，奠定了潮州佛手香黄的基础风味特征。甲硫基丙醛由蛋氨酸通过Strecker降解反应合成[51]，具有煮马铃薯的香味[34,35]，也有研究证明甲硫基丙醛具有肉香及肉汤风味[35]。这一差异可能是不同品牌佛手香黄的腌制过程中的盐腌和干燥过程不同工艺造成的[47]。

在佛手香黄中含量较高的烯萜类物质仍是风味的主要来源之一，累积香气值达44～117。有研究表明在新鲜佛手中，香叶醇（12.14～36.86）和芳樟醇（10.35～52.53）是佛手精油中的关键风味物质[49]，带有花香、木香等香气。在品牌2佛手香黄中该两类物质的相对香气值均高于其他品牌，但随时间变化不明显。另外，具有较高香气活度值的苯乙醛（8.61～28.88），3-甲基丁醛（6.81～20.12）、3-甲基丁醇（23.21～72.20）和壬醛（2.66～4.97）也是佛手香黄风味重要来源之一。苯乙醛有浓郁的玉簪花香气[47]。3-甲基丁醛、3-甲基丁醇和壬醛在佛手风味相关的文献中还未被报道。3-甲基丁醛被描述为麦芽味（刺鼻的辛辣味）[40]，是令人不愉悦的风味。但3-甲基丁醛对香气的贡献取决于化合物的浓度[51]，3-甲基丁醛在低浓度下，该味会变得果香而令人愉悦[40]。3-甲基丁醇青香、带有刺激性[41]，霉味、焦糊[42]。壬醛有坚果烤香味[48]。

alpha-松油醇-M、alpha-松油醇-D、月桂烯-D、alpha-蒎烯、己醛、beta-罗勒烯是新鲜佛手精油的主要成分[49]。经过腌制炮制后，在潮州香黄中它们均ROAV＜1，作为风味协调成分。这些物质对佛手香黄的风味具有协调作用，使风味更加浓郁，和谐。

2.3 动态主成分分析

利用SIMCA-P软件对不同品牌的佛手香黄样品挥发性化合物进行主成分分析，结果如图3所示。

图3 佛手香黄挥发性物质的主成分分析Fig.3 PCA analyzed of volatile compounds of Lao-Xiang-Huang preserved

PCA分析可通过对大量数据进行降维，减少数据冗余。本研究通过SIMCA-P软件对8组样品进行主成分分析。主成分1贡献率为34.3%，主成分2贡献率为24.9%，累计贡献率为59.2%，可以有效解释总变异的59.2%的原始数信息，通过二维空间分布可以直观观察到组间及组内的差异。同组样品距离相近，组内差异小，样品间重复性较好。由图3可知，同一品牌的佛手香黄分布距离较近，不同品牌区分度较大，主要差异体现在PC1上。而同一品牌不同储存时间的样品也有一定的区分度，主要差异体现在PC2上。上述结果表明，GC-IMS可对不同品牌的潮州佛手香黄进行分类鉴别，可用于鉴别佛手香黄来源，建立溯源体系。

2.4 不同品牌佛手香黄挥发性成分差异分析

通过SIMCA-P软件对不同品牌的佛手香黄的挥发成分建立PLS-DA模型。PLS-DA是有监督的分析，有助于高维数据的可视化、判别分析与代谢变化有关的潜在代谢物。经PLS-DA分析，R2X=0.92，R2Y=0.977，Q2=0.943，R2X和R2Y分别表示模型所能解释X和Y矩阵信息的百分比，当R2X-R2Y＜0.3，Q2＞0.5代表该模型较可靠。利用置换检验对PLS-DA模型建立结果进行检验，如图4。右侧R2Y及Q2值为真实值，左侧为预测值，当预测值均低于真实值且R2Y与Q2的回归线斜率大于1，Q2截距为负值时，模型预测结果稳定性较好，未出现过拟合现象。

图4 佛手香黄挥发性物质的PLS-DA Permutations图Fig.4 PLS-DA permutations test of Lao-Xiang-Huang preserved

通过模型相对应的载荷图分析不同品牌佛手香黄的差异化学成分，以变量重要性投影（VIP）值描述变量的贡献程度，当VIP值＞1时，该物质可认为是重要差异物质。其VIP值见图5，初步筛选出VIP值＞1的18个差异化学成分。

图5 佛手香黄挥发性物质的VIP图Fig.5 VIP analysis of Lao-Xiang-Huang preserved

采用单因素方差分析对3个品牌的佛手香黄的18个差异性物质进行显著性分析，筛选p＜0.05的物质，继续筛选出15个差异物质，包括2-糠醇-D、乙醇-D、乳酸乙酯、2-二甲基乙酸、乙酸乙酯、5-甲基糠醛-D、alpha-水芹烯-D、柠檬烯-D、香叶醇、alpha-松油醇-D、香茅醛、1-苯乙醇、松油烯-4-醇、2-乙酰基呋喃-D、丙酮。利用热图对差异性化学成分的峰强度数值进行比较，见图6。

图6 佛手香黄差异挥发性物质的热图Fig.6 Heatmap of differential volatile substances Lao-Xiang-Huang preserved

由图6结合单因素方差分析结果，品牌1的标志挥发性化合物为2-糠醇-D，品牌2的标志挥发性化合物为乙醇-D、乳酸乙酯、2-二甲基乙酸、乙酸乙酯、5-甲基糠醛-D、alpha-水芹烯-D、柠檬烯-D、香叶醇、alpha-松油醇-D、香茅醛、1-苯乙醇。品牌3的标志挥发性化合物为松油烯-4-醇、2-乙酰基呋喃-D、丙酮。

3 结论

本文利用GC-IMS检测佛手香黄挥发性风味物质由8种酯类、15种醛类、11种醇类、3种酮类、23种烯萜类、6种酸类、3种呋喃类、1种噻唑类和1种吡嗪类组成。利用GC-IMS结合ROAV分析确认佛手香黄的特征性风味成分主要由甲硫基丙醛和烯萜类物质组成，呈现果香、花香的风味特征。结合PCA、PLS-DA和单因素方差分析了不同品牌的挥发性化合物的变化，筛选出15个标志挥发性化合物。标志成分既反映佛手香黄风味的本质特征，又有助于进一步建立专属性、针对性的质量评价方法和质量标准，为佛手香黄质量控制及质量溯源体系及辨别伪劣提供理论基础。