大气颗粒物中细菌群落结构的区域差异性研究*

张 波, 马曼曼, 孙宇航, 冯文荣, 米铁柱, 甄 毓**

(1. 海洋环境与生态教育部重点实验室, 山东 青岛 266100；2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266237；3. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东 青岛 266100)

生物气溶胶是直接从生物圈释放到大气中的大气粒子的一个子集，其粒子直径范围从纳米到约十分之一毫米之间[1]。生物气溶胶是大气气溶胶的重要组成部分。Huffman等[2]对亚马逊雨林中的生物气溶胶检测发现，生物气溶胶粒子数占大气颗粒物数的30%～80%。生物气溶胶还包括许多不同来源的生物颗粒或大分子，例如病毒、细菌、真菌、花粉、细胞碎片和生物膜等[3]。通过空气传播的生物气溶胶可以引起人类疾病[4-5]，也在大气化学和成核过程中起着重要作用，例如有机物的生物转化、碳循环、光化学反应和云形成等过程，从而可能影响气候和环境[1,6]，目前已有不少研究集中于通过分析生物气溶胶中微生物群落组成和结构[7]，了解其对全球气候和环境变化以及人类健康等方面的影响。高通量测序技术能够在基因水平上较为全面地反映微生物群落结构和多样性特征，因而被广泛应用在大气微生物研究中[8-9]。

近年来针对大气中微生物的研究越来越多，研究发现，大气中可能存在几种常见细菌组成的微生物背景[10]，且这些细菌在大气环境中普遍存在，但随着空间、时间和大气颗粒物粒径等的变化，大气中优势菌的组成及占比会发生改变[8]，并且这些因素可能会影响细菌群落结构。例如，Despres等[11]发现不同区域(乡村、城市、沿海、海平面和高山等)空气中细菌群落的多样性和细菌种类的组成存在一定的差异；武丽婧[12]对比了青岛和黄海气溶胶中的微生物群落，发现陆地生物气溶胶中微生物群落的丰富度高于海洋。除了区域的变化可能会对大气中细菌群落结构产生影响外，时间或季节的变化也可能产生影响。例如，在米兰的较冷季节，Burkholderiales和Actinomycetales的相对丰度更高，而Chloroplasts是温暖季节下大气细菌群落的优势菌[13]；Du等[14]研究发现，北京春季样品中的微生物群落的丰富度高于其他季节。此外，有学者发现，不同粒径的大气颗粒物上的微生物对环境的耐受能力不同[15]，可能导致生物气溶胶中不同粒径的微生物群落结构发生改变。Lu等[16]发现西安市生物气溶胶中TSP(Total Suspended Particulate)的细菌群落丰富度和多样性高于PM2.5和PM10；Bowers等[17]分析发现美国科罗拉多州大气中粗颗粒(PM10～2.5)细菌群落的丰富度高于细颗粒(PM2.5)，且假单胞菌和梭菌的相对丰度的差异是导致粗、细颗粒细菌群落结构有所差异的主要原因。已有研究显示，沿海、内陆以及海洋等区域的生物气溶胶中微生物群落结构和种类存在差异，以及不同粒径范围内的微生物群落结构特征也存在一定的差异[18-20]，但区域和大气颗粒物粒径的差异对细菌群落结构的影响机制尚不明确。除此之外，相对湿度、温度、风向、风速和气态污染物(O3、SO2、NO2和CO等)等环境因素对大气微生物的多样性和群落结构也可能产生不同程度的影响[21-22]，但因研究区域以及天气条件不同，环境因子对于细菌群落结构的影响机制还需要进一步分析。

青岛濒临黄海，该地气溶胶中细菌群落结构可能受海洋和陆地源的共同影响[23-25]。兰州地处西北内陆地区，受亚洲沙尘的影响在春季容易发生沙尘暴[26-27]。此外，亚洲沙尘还可以经内蒙古西部和黄土高原后输入黄渤海，兰州和青岛均位于该传输路径上[26,28]。海洋微表层是微生物从水体进入大气的主要来源，海洋气溶胶可以通过海-气界面并且能在大气中进行长距离传输[29]。因此，本研究分别在青岛、兰州和黄海设置采样点，对不同地点和不同采样时间的大气细菌群落结构特征以及不同环境因子对群落结构的影响进行比较分析，了解海洋、沿海和内陆大气细菌群落结构特征的异同。

1 材料与方法

1.1 样品采集

1.1.1 海上样品采集 2014年3月18日，作者搭乘“东方红2”于黄海(33°44.040′N—33°19.394′N，124°43.232′E—125°21.874′E)采集生物气溶胶样品。为防止污染，只在船航行期间采集，停船时将采样器关闭。

采用FA-1筛孔撞击式空气微生物采样器(辽阳康洁仪器研究所)采集样品，采样器流量为28.3 L/min，采样时长为1 h。采样膜为0.22 μm的聚碳酸酯膜(北京升河诚信膜科技发展有限公司)。在采集样品前，对需要用到的实验用具进行高压灭菌，防止受到污染。然后在超净台中将烘干后的滤膜放入用酒精灭菌后的采样器中。完成采样后，在超净台内用铝箔将采样膜包好，并放入-20 ℃冰箱保存，以待后续分析。

1.1.2 陆地样品采集 采样点位于兰州市西北师范大学生科楼楼顶(36°07′N，103°43′E)和青岛市中国海洋大学崂山区教学楼六区天台(36°09′N，120°29′E)。两个采样点周围均无明显的污染源，受人类活动影响较小。青岛的采样时间为2015年1月7日、3月25日和8月16日，兰州的采样时间为2015年3月24和27日。同样使用FA-1筛孔撞击式空气微生物采样器采集样品，采样器流量为28.3 L/min，采样时长为30 min，采样膜为0.22 μm的聚碳酸酯膜，生物气溶胶样品采样前的准备工作同上述海上样品采集。在采样期间，记录各采样点的气象条件(见表1)。

FA-1筛孔撞击式空气微生物采样器采用惯性撞击原理进行设计，它分为六级且每级对生物气溶胶的捕集范围分别为0.65～1.1 μm、1.1～2.1 μm、2.1～3.3 μm、3.3～4.7 μm、4.7～7.0 μm和大于7.0 μm，随着采样器每级筛孔直径的缩小，其空气流速逐渐增大(最大可达23.14 m/s)，从而把气溶胶样品分粒径采集到采样膜上[12]。根据采样器对粒径分割的限制和气溶胶粗细粒子粒径范围的划分[30]，本文用f表示细粒径(小于2.1 μm)，c表示粗粒径(大于2.1 μm)，分别将黄海(YS)、青岛(QD0107、QD0325和QD0816)和兰州(LZ0324和LZ0327)的样品分为粗细粒径两组(见表1)。

表1 2014—2015年黄海、青岛和兰州生物气溶胶采样期间气象资料

1.2 样品处理

1.2.1 细菌总DNA提取与检测 在超净台内，将采样膜剪碎放入2 mL离心管中，利用(QIAamp DNA Mini Kit)试剂盒进行DNA提取。对提取的总DNA利用细菌16S rDNA引物341F(5 ′-CCTACGGGRSGCAGCAG)和806R(5 ′-GGACTACCAGGGTATCTAAT)进行PCR扩增,然后对扩增产物在2%的琼脂糖凝胶下进行电泳检测[12]，将合格的DNA样本送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。

1.2.2 高通量测序 将提取的DNA样品作为PCR反应模板，扩增16S rRNA基因的V3-V4区。其中，PCR反应正反引物分别是341F和806R，扩增后得到约466 bp的扩增片段，检测合格后加测序接头并通过HiSeq2×250测序平台测序。

1.3 数据处理

1.3.1 质量控制 通过Pandaseq[31]软件(version 2.9)将双末端测序得到的成对的Reads拼接成一条序列，可以得到高变区的原始序列，然后将拼接的序列进行质量控制(将平均质量低于20和3个以上含N碱基的序列去除)得到有效序列，进行后续的生物信息学分析。

1.3.2 OTU聚类 将有效序列中的Singletons过滤，利用Uparse[32]软件(version 7.0.100 1, http://drive5.com/uparse/)在97%的相似度下对非重复序列的操作分类单元(Operational Taxonomic Unit, OTU)进行聚类。在聚类过程中去除嵌合体，得到的OTU可以用于物种分类。然后，从各个样品的OTUs中选出丰度最高的一条序列作为代表序列，与已知物种的16S rDNA数据库(GreenGenes[33], http://greengenes.l bl.gov)进行比对，从而进行物种注释。最后，根据对每个OTU序列的条数得到的OTU分类表，并分析物种丰度和热图。

1.3.3 生物信息学分析 通过QIIME[34]软件(version 1.9.0)计算样品的Alpha多样性指数。使用R软件中VeenDiagram程序包绘制韦恩图(Veen图)，并绘制稀释曲线，分析不同样品OTU组成的相似性；用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)图和聚类热图，来反映样品间是否存在细菌群落差异。

1.3.4 环境因子对细菌群落影响分析 利用Canoco 5软件进行典范对应分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)，找到可能对细菌群落结构产生显著影响的环境因子，以显示环境因子对细菌群落的影响，并通过蒙特卡洛检验进行统计学检验。

1.3.5 后向轨迹分析 利用拉格朗日混合单粒子轨道模型(Hybrid Single-Particle Lagrangian Integrated Trajectory, HYSPLIT)[35]分别对黄海、青岛和兰州的3个采样点进行后向轨迹分析，根据GDAS1气象数据集和基于垂直速度垂直运动法的模型，由于500 m的高度可以准确反映大气边界层平均流场的特征[36]，将其作为该模型起始高度，计算在此高度下后推72 h的后向轨迹。

2 结果

2.1 大气细菌群落多样性分析

结6组(共12个)粗细粒径样品测序，共得到1 013 295条有效序列，对所有样品的序列经均一化处理后，在97%的相似度水平下聚类，6组样品共获得5 708个OTUs，且每组样品OTU数介于639与2 079之间。

3月青岛QD0324和兰州LZ0324和LZ0327共有856个OTUs，约占总OTU数的15.00%，但与黄海均没有共有OTU(见图1(a))，表明黄海和陆地(青岛和兰州)样品气溶胶中细菌种类明显不同。青岛不同采样时间的生物气溶胶样品中只有1个共有OTU，且1和8月样品共有332个OTUs，说明这2个月份的青岛生物气溶胶中细菌种类差异较小。

((a)3月黄海、青岛和兰州；(b)青岛不同采样时间。(a) The Yellow Sea, Qingdao and Lanzhou in March; (b) Different sampling time in Qingdao.)图1 2014—2015年黄海、青岛和兰州生物气溶胶OTUs韦恩图

在所有样品中(见图2(a))，兰州样品LZ0327c气溶胶的OTU数目最多，有1 625个，青岛样品QD0816f气溶胶的OTUs最少，为333个； 黄海样品中粗细粒径OTU个数的差值最低(p<0.05)；而LZ0327气溶胶样品中粗细粒径OTU个数的差值大于LZ0234样品(p<0.05)，说明LZ0327比LZ0324样品气溶胶中粗细粒径OTU的相似性低。在青岛3个采样时间的样品中，QD0325气溶胶中粗细粒径OTUs相差最大，其次是QD0816样品，最小是QD0107样品(p<0.05)。

黄海、青岛和兰州粗细粒径样品的Goods_coverage指数均大于98%，表明此时的测序深度已经基本涵盖细菌类群的信息，结果能够呈现出样本真实情况。Chao 1值表示细菌群落的丰富度，即Chao 1值越大细菌群落越丰富。由图2(b)可知，兰州样品LZ0327c气溶胶中细菌群落丰富度最高，而青岛样品QD0816f气溶胶中细菌群落丰富度最低(p<0.01)；各个样品的粗细粒径气溶胶中，QD0325生物气溶胶样品中粗粒径细菌群落丰富度低于细粒径，其余则相反；LZ0327粗细粒径样品的细菌群落丰富度差异最大，黄海粗细粒径细菌群落丰富度差异则最小(p>0.05)。Shannon和Simpson指数均可以衡量细菌群落多样性。其中，黄海粗粒径细菌群落多样性最高，青岛样品QD0816f细菌群落多样性最低(p<0.01)，且QD0816样品粗细粒径细菌群落多样性差异相对较大(p<0.05)(见图2(c)和图2(d))。

图2 2014—2015年黄海、青岛和兰州生物气溶胶中粗粒径和细粒径上OTU数(a)、细菌群落多样性指数Chao 1指数(b)、Shannon指数(c)及Simpson指数(d)

2.2 大气细菌群落结构相似性分析

根据属分类水平上相对丰度数据进行主成分分析可知(见图3)，3月27日兰州样品粗细粒径细菌群落结构差异较大，说明该样品粗细粒径细菌群落结构相似性较低，但其他样品粗细粒径细菌群落结构差异较小。从整体上看，黄海与其他陆地样品气溶胶的细菌群落结构的差异明显，说明黄海和陆地样品细菌群落结构的相似性较低。ANOSIM检验表明，组间差异显著大于组内差异(R=0.822，p<0.01)，即黄海、青岛和兰州以及青岛不同采样时间的生物气溶胶中细菌群落结构的差异显著大于同一气溶胶样品中粗细粒径细菌群落结构的差异。

图3 2014—2015年黄海、青岛和兰州生物气溶胶中粗粒径和细粒径样品主成分分析

对物种数据(OTUs)进行聚类分析(见图4)，结果显示3月的青岛和兰州样品聚为一支，说明同一时期陆地生物气溶胶中细菌群落结构差异性较小；但3月黄海与陆地(青岛和兰州)样品聚类距离较长，表明黄海样品与陆地样品细菌群落结构差异较大。青岛不同采样时间的样品中，1和8月样品的聚为一支，说明青岛冬季和夏季生物气溶胶中细菌群落结构相似性较高。

图4 2014—2015年黄海、青岛和兰州生物气溶胶样品中细菌群落结构基于Bray-curtis距离的聚类分析

2.3 大气细菌群落结构组成分析

在门分类水平上(见图5(a))，变形菌(Proteobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、放线菌(Actinobacteria)和拟杆菌(Bacteroidetes)为黄海、青岛和这3个采样点气溶胶样品的优势菌，它们在黄海、兰州和青岛粗细粒径气溶胶中的相对丰度之和均超过75%，在样品QD0325和LZ0324的粗细粒径中甚至达到90%以上。这各个采样点粗粒径样品中，Proteobacteria相对丰度均低于其在细粒径中的相对丰度，Firmicutes则相反；兰州LZ0324样品Actinobacteria的相对丰度在粗粒径气溶胶高于细粒径，其余样品则相反；青岛QD0107、QD0325和兰州LZ0327样品Bacteroidetes的相对丰度在粗粒径气溶胶低于细粒径，其余样品则相反。

在属分类水平上(见图5(b))，黄海细粒径气溶胶中，拟杆菌(Bacteroides,4.81%)的相对丰度最高，粗粒径气溶胶中假单胞菌(Pseudomonas,10.87%)的相对百分比最高；在青岛样品中，QD0107的细粒径气溶胶中假单胞菌(Pseudomonas,22.93%)的相对丰度最高，粗粒径气溶胶中韦荣氏球菌(Veillonella,7.12%)的相对丰度最高；QD0325细粒径气溶胶中嗜冷杆菌(Psychrobacter,24.38%)相对丰度最高，粗粒径气溶胶中类芽孢杆菌(Paenibacillus,31.57%)的相对丰度最高；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)在QD0816粗细粒径气溶胶中的相对丰度均是最高的且分别达13.93%和64.66%。在兰州样品中，LZ0324细粒径气溶胶中双歧杆菌(Bifidobacterium,22.07%)和韦荣氏球菌(Veillonella,22.80%)为优势菌，双歧杆菌(Bifidobacterium,1.87%)为粗粒径气溶胶的优势菌；LZ0327细粒径气溶胶中不动杆菌(Acinetobacter,23.53%)为优势菌，双歧杆菌(Bifidobacterium,9.73%)为粗粒径气溶胶的优势菌。综上可得，不同区域甚至是同一区域的不同采样时间细菌群落的优势菌是不同的，而且同一样品粗、细优势菌组成也是不同的。

图5 2014—2015年黄海、青岛和兰州粗粒径和细粒径生物气溶胶中(a)优势菌门和(b)优势菌属的相对丰度

2.4 环境因子对大气细菌群落结构的影响

首先，对物种数据(OTUs)进行去趋势对应分析(Detrended correspondence analysis，DCA)，根据分析结果，若最大轴长大于4.0则选择典范对应分析(Canonical correspondence analysis，CCA)，小于3.0则选择冗余分析(Redundancy analysis，RDA)，介于3.0～4.0之间两者均可。DCA分析结果表明，CCA更适合用来分析2014—2015年黄海、青岛和兰州大气细菌群落结构和环境因子间的相关性。2014—2015年细菌群落结果和环境因子(温度、风速和相对湿度)的典范对应分析(见图6)和置换检验表明，风速对细菌群落结构具有显著影响(p<0.01)。

图6 2014—2015年黄海、青岛和兰州生物气溶胶中细菌群落结构与环境因子的典范对应分析

2.5 后向轨迹分析

分别将黄海、青岛和兰州生物气溶胶样品采样时的北京时间均转化为协调世界时(Coordinated Universal Time，UTC)，并对这3个采样点500 m的高度进行72 h后向轨迹分析(见图7)。结果表明，除青岛QD0816采样点的气团来自海洋源外(见图7(d))，其余采样时气团均来自陆地源，虽然这些气团来自不同的地区，但均是通过长距离气团传输。

((a)YS；(b)QD0107；(c)QD0325；(d)QD0816；(e)LZ0324；(f)LZ0327。 (a) YS; (b) QD0107; (c) QD0325; (d) QD0816; (e) LZ0324; (f) LZ0327.)

3 讨论

3.1 时空差异性分析

细菌广泛分布于大气气溶胶中，是大气环境的重要组成部分。经高通量测序，黄海气溶胶样品中细菌群落多样性略高于陆地(青岛和兰州)(p<0.01)，青岛样品中细菌群落的多样性高于同时期的兰州样品(p<0.01)。随着测序方法和建库深度等技术的不断进步，本研究中细菌群落的丰富度和多样性远高于之前对挪威海[41]和韩国首尔沙尘和非沙尘天气下[39]的生物气溶胶的研究结果(见表2)。黄海气溶胶中细菌群落的丰富度和多样性高于渤海[10](见表2)。根据后向轨迹的结果所示，黄海的气团主要来自西北方向的陆地气团，即细菌群落结构受陆地气团影响较大，可能导致细菌群落的丰富和多样性高于其他海域。但青岛和兰州的细菌群落的丰富度低于中国常州市[38]以及泰山部分时间段的生物气溶胶样品[37](见表2)，不同地区由于气象因素和微生物的来源不同，生物气溶胶在空间分布上存在一定的差异。同时，由于气候条件和周围环境的变化，同一地点生物气溶胶的微生物也会发生季节性变化[12]。本研究中发现，3月份青岛生物气溶胶中细菌群落的丰富度和多样性均高于1和8月(p<0.05)，即春季大气生物气溶胶中细菌群落的丰富度和多样性高于冬季和夏季。

表2 2014—2015年黄海、青岛和兰州细菌群落多样性与国内外对比一览表

对生物气溶胶中OTU分布情况进行统计分析后，3月的黄海与陆地(青岛和兰州)没有共有OTUs(细菌核心类群)，表明这些样品的生物气溶胶中细菌独有物种数较高。后向轨迹分析表明，3月黄海、青岛和兰州这三地的气团均是陆地源，但气团来源地和远距离传输路径不同，且对于进行远距离传输的微生物会受到大气中恶劣环境条件的影响，如极端气温，干燥的天气和强烈的紫外线等[42]，这都可能是导致不同地点生物气溶胶样品中的物种出现明显差异的原因。聚类分析结果表明，3月青岛和兰州样品聚为一支，说明陆地群落结构较为相似；但3月黄海与陆地(青岛和兰州)样品聚类距离较长，表明黄海样品与陆地样品细菌群落结构差异较大。已有研究结果可知黄海OTU数最高，且优势菌门中拟杆菌占比最高，这可能导致该样品的细菌群落结构与同时期陆地样品差异较大。同时，青岛不同采样时间的生物气溶胶中只有1个共有OTU，又由于不同采样时间的气团来源不同，大气气流对于细菌群落结构的影响也是不同的。主成分分析表明，黄海与其他陆地样品气溶胶中细菌群落结构的差异明显，说明黄海和陆地样品细菌群落结构的相似性较低。组间差异分析的结果也表明，黄海、青岛和兰州以及青岛不同采样时间的生物气溶胶中细菌群落结构的差异性显著大于同一气溶胶样品中粗细粒径细菌群落结构的差异(p<0.01)。海洋气溶胶可以直接从海水表层产生[43]，或者通过远距离大气传输或沿海地区的海陆风将陆地气溶胶传输到海洋空气中[44]，所以海洋气溶胶可能受海洋源和陆地源共同影响，其微生物群落结果与其他陆地样品存在差异性。Fang等[45]对杭州市的不同季节4个地点空气进行采集，其结果表明不同采样点细菌浓度存在显著差异，且不同采样点细菌浓度呈季节性变化。

本研究现黄海、青岛和兰州各个生物气溶胶中粗细粒径的优势菌分别均是Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes。Seifried等[46]对从北海到波罗的海的不同海域的细菌群落研究发现，最丰富的细菌同样是这4种细菌；且这4种细菌在春季常州市和石河子市的细菌群落中丰度也最高[38,47]。现有研究发现，不同采样点地理位置和环境因素等不同，其生物气溶胶中细菌的优势菌也存在一定的差异[10,37-41](见表2)。研究还发现，黄海、青岛和兰州生物气溶胶中细菌的优势菌属是不同的，Pseudomonas在黄海和青岛气溶胶样品中丰度均相对较高，但在兰州则丰度很低。在一些海洋或者沿海地区的生物气溶胶研究中发现Pseudomonas是主要菌属[20,46,48]，并且它们也主要寄生于植物中，说明植物也可能是空气微生物的来源之一[38,49]，但兰州地处中国西北地区，气候干旱且植被覆盖率不高，这可能导致Pseudomonas含量不高。Bacteroides在黄海气溶胶样品中的丰度值高于陆地样品，Ma等[10]也发现渤海、黄海和西北太平洋气溶胶中Bacteroides是细菌群落的优势菌属。Seifried等[46]提出大气中可能存在稳定的“细菌核心群落”，可能来自热带雨林、大型草地或土壤等区域，它们可以在长距离传输中不断分布和混合，例如拟杆菌和假单胞菌，是海洋和沿海生态系统生物气溶胶研究中的优势菌。而青岛和兰州采样点气溶胶中有些细菌，例如Veillonella、Bifidobacterium、Psychrobacter和Paenibacillus等细菌在黄海海域气溶胶样品中丰度极低，表明这些属种很大可能来源于陆地。此外，同一采样点的不同采样时间，其生物气溶胶中细菌群落的优势菌属也不同的。在8月青岛的生物气溶胶中Sphingomonas的相对丰度远高于1和3月，Sphingomonas在高温、紫外线和严寒等不利的环境变化下，能高效调整自身的生长来抵抗[50]，本研究中8月采样时正值夏季，温度高且紫外线强烈，这使得Sphingomonas相对丰度值升高；而Psychrobacter和Paenibacillus只有在3月的青岛样品中才检测到，表明不同时间的生物气溶胶样品中有各自特异的菌种存在。因此，由于空间和时间的不同，环境、气团传输轨迹和微生物来源等也是不同的，这可能导致细菌群落的多样性、结构和优势菌的组成等在不同空间和时间分布上存在差异，且生物气溶胶样品中有各自特异的菌种存在。

3.2 粒径差异性分析

黄海气溶胶中粗细粒径细菌群落丰富度差异较小，但3月27日兰州样品中粗细粒径细菌群落的丰富度差异较大(p>0.05)。现有研究发现，微生物主要分布在粗粒径中[24,51]，Lu等[16]研究发现粗粒径(PM10～2.5)细菌丰富度高于细粒径(PM2.5)；Ma等[10]发现黄海和西北太平洋气溶胶中粗粒径细菌多样性高于细粒径。但本研究发现，仅3月25日青岛生物气溶胶样品中粗粒径细菌丰富度低于细粒径，有研究发现沿海地区粗颗粒气溶胶的浓度受风速和相对湿度等环境因子的影响，即在相对湿度或风速较低时，粗粒径气溶胶浓度会降低，而细颗粒容易保持其在大气中的悬浮状态长达几天或几周，并且可以进行长距离传输[52]。在本次采样期间，QD0325样品采样时风速(约3.8 m/s)小于其他样品，这可能导致该青岛气溶胶样品粗粒径细菌的丰富度低于细粒径。兰州LZ0324样品采样时相对湿度和风速均高于LZ0327样品且伴有沙尘天气[53]，使得从3月24—27日生物气溶胶中粗粒径细菌的丰富度和多样性增加速度大于细粒径。研究发现沙尘发生时，约55%的微生物附着在粗颗粒上(>5 μm)，仅约7%的微生物附着在细颗粒上(1～2 μm)[54]。通过主成分分析也可以发现，兰州LZ0324样品粗细粒径细菌群落结构差异明显高于其他样品。同一时期李洪涛等[55]发现，兰州沙尘发生时微生物浓度的增加主要由于长距离的沙尘颗粒携带大量的外源微生物。该时期兰州采样点气团的后向轨迹分析也可以看出，气团主要来自俄罗斯和蒙古国等北方地区的长距离传输。

Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes也是黄海、青岛和兰州生物气溶胶中粗细粒径细细菌群落的优势菌门，但这4种优势菌的相对丰度值在粗细粒径细菌群落中是不同的(p<0.01)，例如，Proteobacteria主要存在细粒径细菌群落中，而Firmicutes则在粗粒径细菌群落中丰度较高。可能是Firmicutes在大气中主要以细菌聚合物的形式存在于粗粒径气溶胶中，而Proteobacteria主要以孢子状态存在于大气细粒径中且含量较高[56]。尤其是在3月27日发生沙尘时，LZ0327细粒径样品中的Proteobacteria明显高于LZ0324细粒径样品。Polymenakou等[57]通过对东地中海沿海城市空气中微生物粒径分布的测定发现，在大粒径颗粒物(>3.3 μm)中厚壁菌丰度较高，而在小粒径颗粒物(<3.3 μm)中放线菌和拟杆菌丰度更高。黄海、青岛和兰州粗细粒径样品的优势菌属也存在明显的差异。例如，Bacteroides在黄海粗粒径样品中的相对丰度高于细粒径；Psychrobacter和Paenibacillus分别是QD0325粗细粒径中的优势菌；沙尘发生时，兰州细粒径样品中的优势菌由Bifidobacterium转为Acinetobacter，粗粒径样品中的优势菌仍是Bifidobacterium但相对丰度值发生增长。现有研究发现，粗颗粒可以包裹细菌从而减少细菌受到紫外线辐射，还可以为细菌生长和繁殖提供丰富的营养物质；但细颗粒较大的比表面积导致细菌受到外界环境的影响较大，因此粗颗粒物上的细菌对环境急剧变化的适应能力较细颗粒物上的要强[16]，使得粗细粒径样品中的细菌组成和结构上发生变化。

3.3 环境因子对大气细菌群落结构的影响

现有研究表明，采样点之间细菌群落组成的差异可能会受到采样点的选择及其附近生态系统的影响[46]。通过后向轨迹分析，除了QD0816采样的气团来自海洋源，其余黄海、青岛和兰州采样点的气团均主要来自陆地源，但这些生物气溶胶中细菌群落结构之间存在差异，说明生物气溶胶中细菌类群可能受到地理位置和环境因子的影响。Wei等[58]通过分析华北平原生物物质燃烧扰动后细菌和真菌群落结构特征，认为环境因子与微生物类群密切相关。此外，同一采样点在季节分布上其微生物的群落结构也具有一定的差异性，这些差异主要是因为采样时的气候条件、气象因子和微生物来源等因素，使得生物气溶胶中微生物的种类和群落结构产生差异。同时，同一采样点粗细粒径细菌群落结构差异可能是由于细菌在传播过程中的不断混合并且其来源发生了变化，以及受当地气象条件的影响。本研究观察到的环境因子中，风速对细菌群落结构有显著影响(p<0.01)，风速对微生物的影响主要表现为风速较大时使得大气边界层发生扰动，导致大气颗粒物悬浮且微生物的浓度增加，但如果风速过大则会对大气中微生物起到稀释的作用，降低大气中微生物浓度[22]。

4 结论

在本研究中，基于16S rRNA基因的高通量测序技术分别对黄海、青岛和兰州的采样点大气细菌群落结构特征进行对比分析，获得以下结论：

(1)组间差异分析的结果表明，黄海、青岛和兰州以及青岛不同采样时间的生物气溶胶中细菌群落结构的差异性显著大于同一气溶胶样品中粗细粒径细菌群落结构的差异(p<0.01)。具体表现为，黄海气溶胶样品中细菌群落多样性略高于陆地(青岛和兰州)(p<0.01)，青岛样品中细菌群落的多样性高于同时期的兰州样品(p<0.01)，青岛春季大气生物气溶胶中细菌群落的丰富度和多样性高于冬季和夏季(p<0.05)。聚类分析结果表明，3月黄海与陆地(青岛和黄海)细菌群落结构差异较大。受采样位置和环境因子的影响，Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes为这三地生物气溶胶中细菌的优势菌门，但不同采样点甚至是同一采样点的不同采样时间细菌群落的优势菌是不同的。

(2)除3月青岛样品外，其他样品生物气溶胶中细菌群落的丰富度和多样性高于细粒径，其中沙尘发生后，兰州粗细粒径细菌群落的多样性和结构差异较大(p>0.05)。又由于粗细颗粒耐受环境变化的能力不同，可能导致黄海、青岛和兰州粗细粒径细菌群落中的优势菌的相对丰度发生变化。例如，Bacteroides在黄海粗粒径样品中的相对丰度高于细粒径；Psychrobacter和Paenibacillus分别是3月青岛样品中粗细粒径中的优势菌；沙尘发生时，兰州细粒径样品中的优势菌由Bifidobacterium转为Acinetobacter，粗粒径样品中的优势菌仍是Bifidobacterium但相对丰度值增大。

(3)本研究观察到的环境因子中(温度、风速和相对湿度)，风速对细菌群落结构有显著影响(p<0.01)。由于海上样品采样时间受出海航次的影响，不同地点时间分布的差异会对微生物群落有一定的影响。但本研究通过高通量测序技术对不同地点细菌群落结构特征进行了对比分析，获得了对不同时间和不同地点尤其是对海洋和陆地大气微生物群落结构的初步认识，可为研究大范围气溶胶特点提供微生物生态学方面的依据。

致谢：感谢西北师范大学苏雪老师、中国海洋大学环境科学与工程学院钟茜和董立杰同学在样品采集中提供的帮助。