圆柚酮生物转化菌种筛选及培养基组分优化

彭芷芊，曹婷，范刚，李晓，任婧楠，张璐璐

1.华中农业大学食品科学技术学院/环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070；2.武汉食品化妆品检验所，武汉 430040

圆柚酮((+)-nootkatone)是一种双环倍半萜酮，是瓦伦西亚橘烯((+)-valencene)的同类衍生物。圆柚酮是柑橘类水果的典型香气物质，具有非常低的气味阈值[1]，有葡萄柚气味[2]，因此被广泛应用于商业香精和香料领域[3]。圆柚酮除了商业用途外，有多项研究证明其在医学防治[4]、驱虫防治[5]、抑菌[6]等方面也具有很高的价值。

圆柚酮在天然产物中含量很低，而且分离提纯难度高，提取成本大[7]。工业上常通过化学合成[8-10]的方法来生产圆柚酮。然而根据欧洲食品法规，通过化学合成法得到的圆柚酮不能作为天然香料进行销售和使用，这使得合成的圆柚酮在市场流通中受到限制[11]。采用生物合成法或生物转化法生产制备的圆柚酮被认为是天然的，可以添加到食品、化妆品中。

目前已有多项研究利用真菌、细菌和生物酶等将前体物质瓦伦西亚橘烯生物转化生成圆柚酮，但转化技术还有所限制，且圆柚酮产量较低。天然圆柚酮主要存在于柑橘类水果果皮提取物中，推测柑橘果树土壤中有丰富的具有多种降解作用的菌株，故本研究以柑橘果园土壤为样本，旨在筛选出具有圆柚酮高转化量的菌株，为后续圆柚酮的工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种筛选自湖北省华中农业大学柑橘果园土样。

圆柚酮(>97.0%)，购于日本东京化成工业株式会社(TCI)；瓦伦西亚橘烯(>70.0%)，购于美国Sigma公司。

基础培养基：6 g/L Na2HPO4、0.50 g/L NaCl、3 g/L KH2PO4、1 g/L NH4Cl，溶于0.85%生理盐水中。初筛培养基：基础培养基+1%瓦伦西亚橘烯(0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存)。LB培养基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，溶于蒸馏水。

萃取纤维头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)、固相微萃取头，美国Supelo公司；6890N/5975B气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪，美国Agilent公司； THZ-C-1全温振荡器，苏州培英实验设备有限公司；LDZX-50KBS高压灭菌锅，购自上海申安医疗器械厂。

1.2 圆柚酮标准曲线的绘制

准确称取1 g圆柚酮标准品，以无水乙醇为溶剂，分别配制终质量浓度为100、150、200、300 mg/L的圆柚酮标准溶液，于相同的GC-MS条件下测定圆柚酮峰面积，设置3次平行。

1.3 菌种筛选

取适量土样于灭菌生理盐水中混匀，接种于初筛培养基中，37 ℃、120 r/min下培养2～7 d后，稀释涂布分离菌株。

初筛：挑取单菌落接种于初筛培养基中，37 ℃、200 r/min下培养，每隔12 h测1次菌液OD600值，绘制菌株的生长曲线，选取生长良好的菌株进行下一步试验。

复筛：将初筛菌株转接至LB培养基中，于37 ℃、200 r/min下培养，待菌液OD600值达到0.6～0.7后添加0.1%瓦伦西亚橘烯，继续培养至72 h，取培养24、48、72 h的发酵液进行SPME-GC-MS检测，测定产物圆柚酮的含量。

选择圆柚酮产量高的菌株活化后转接至LB培养基中，37 ℃、200 r/min下培养，待菌液OD600值达到0.6～0.7后添加0.1%瓦伦西亚橘烯，继续培养至72 h，取培养24、48、72 h的发酵液进行SPME-GC-MS检测，对转化产物进行测定分析。

根据对转化产物的分析，最终选择圆柚酮转化率及产量最高的菌种进行菌种鉴定。

1.4 GC-MS转化产物分析

顶空萃取条件、气相色谱-质谱条件及定性分析方法参照李晓等[12]。

定量分析：圆柚酮定量采用外标法，其他产物定量采用内标法，内标物质为环己酮。圆柚酮转化率及各挥发性产物质量浓度的计算公式如下：

1.5 菌种形态鉴定及生理生化指标测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]对菌株进行多项生理生化指标测定，包括氧化酶试验、淀粉水解、明胶液化、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、丙二酸盐、运动性试验、甲基红试验、V-P试验等项目。

1.6 16S rDNA 的扩增和序列分析

提取细菌DNA后通过PCR技术扩增16S rDNA，将PCR产物送武汉天一辉远生物科技有限公司测序。通过NCBI网站的Blast搜索获得与筛选菌株同源性最接近的菌株核苷酸序列，用MEGA-X软件构建系统发育树。

1.7 单因素试验确定发酵培养基成分

1)菌株在LB培养基中生长曲线的测定。将菌株接种于LB培养基中，设置3个平行，37 ℃、200 r/min振荡培养，每隔4 h取少量菌液测定OD600值，以无菌的LB培养基为空白对照，一直测定至72 h，绘制菌株在LB培养基中的生长曲线。

2)发酵培养基中碳源对转化效果的影响。基础培养基为LB培养基，分别以麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、β-环糊精、甘油、α-乳糖、蔗糖作为唯一碳源，设置质量浓度为30 g/L，待菌株培养到对数生长期后，添加0.1%瓦伦西亚橘烯，转化24 h，以圆柚酮转化量及转化率为指标，考察碳源种类对Burkholderiasp. PZQ14转化生成圆柚酮的影响。

3)发酵培养基中氮源对转化效果的影响。蛋白胨作为有机氮源，被广泛应用于微生物和动物细胞培养基中，对微生物的生长发育有着重要作用。分别以20 g/L的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、NH4Cl、(NH4)2SO4作为单一氮源，考察氮源种类对转化效果的影响，转化条件同本文“1.7 2)”。

4)发酵培养基中金属离子对转化效果的影响。无机盐不仅是生物体内酶或者辅酶的激活剂，而且在维持细胞结构和生物大分子稳定性方面也起着关键作用。分别添加0.5 g/L 的CaCl2、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O，考察无机盐对转化效果的影响，转化条件同本文“1.7 2)”。

1.8 响应面试验确定最佳发酵培养基组分

以单因素试验结果为基础，结合Box-Benhnken试验设计原理，以圆柚酮转化量为响应值，考察葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、Fe2+(C)不同浓度组合对响应值的影响。响应面试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平 Table 1 Code and level of independent varlables used for Box-Behnken design g/L

1.9 数据统计与分析

本试验所有测定重复3次，数据均以“平均值±标准差”表示，采用Excel 2019、Orgin 2019与Design-Expert.V8.0.6.1软件进行分析与绘图。用SPSS 20.0进行ANOVA单因素方差分析，采用Duncan’s法检验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 圆柚酮标准曲线及初筛菌株生长曲线的绘制

利用GC-MS测定不同浓度的圆柚酮峰面积，以圆柚酮浓度为横坐标，圆柚酮峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线。利用Excel和Origin进行线性回归分析，所得的回归方程为y=435876.89x-3109148.40，R2>0.99，表明回归方程拟合度好，即该标准曲线可用于后续试验定量分析。

将土样的菌悬液在初筛培养基中培养5 d，期间通过检测培养液的OD600值来判断是否有菌生长。将培养液稀释涂布平板，从稀释比例为10-5的平板中挑取了16个单菌落，分别在初筛培养基中培养，每隔12 h测培养液的OD600值，绘制16个菌株的生长曲线。如图1所示，根据生长曲线，从中选出生长状况良好的菌株1、2、3、4、5、9、13、14、15进行下一步试验。

A：菌株1～8的生长曲线；B：菌株9～16的生长曲线。A:Growth curve of strains 1-8; B:Growth curve of strains 9-16.

2.2 复筛菌株转化生成圆柚酮产量的对比

将初筛选出的菌株进行富集培养，加入底物瓦伦西亚橘烯，利用GC-MS检测产物中圆柚酮的含量，并设置不接菌株仅加入底物的培养基作为空白对照。由图2可知，转化24 h时，转化生成圆柚酮产量较高的是菌株3、14；转化48 h时，转化生成圆柚酮产量最高的是菌株3、5、9、14；转化72 h时，转化生成圆柚酮产量最高的是菌株3、5、9、14。根据圆柚酮的产量，最后选择菌株3、5、9、14进行下一步试验。

图2 复筛菌株转化生成圆柚酮产量的比较

2.3 菌株的GC-MS转化产物分析

对菌株3、5、9、14进行富集培养，待菌液的OD600值达到0.6～0.7后，加入底物瓦伦西亚橘烯，再继续培养72 h，并分别取培养24、48、72 h的发酵液，利用GC-MS对转化产物的种类及含量进行检测分析，其中圆柚酮作为目标产物，其含量是通过外标法计算，其他产物均采用内标法进行定量。结果如表2所示，这4株菌株生物转化的产物种类及含量大致相同，包括α-松油醇、二氢香芹醇、(+)-二氢香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯、β-紫罗酮、圆柚酮等7种物质，其保留指数(RI)分别为1 101.44、1 105.81、1 114.19、1 203.96、1 382.14、1 387.61、1 705.19。

表2 筛选所得菌株在24、48、72 h对瓦伦西亚橘烯的转化产物含量 Table 2 Concentration of valencene biotransformation products obtained during different periods (24 h，48 h，72 h) mg/L

对于菌株3，在最初的24 h，主要产物有α-松油醇、二氢香芹醇、(+)-二氢香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯、β-紫罗酮、圆柚酮，目标产物圆柚酮含量为48.40±9.43 mg/L。转化48 h后，圆柚酮含量增加(58.81±7.33 mg/L)；转化72 h后，圆柚酮含量继续增加(67.17±1.64 mg/L)，其他大部分产物含量随着转化时间延长而减少。

对于菌株5，在最初的24 h，主要产物有α-松油醇、(+)-二氢香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯，目标产物圆柚酮含量为50.60±4.33 mg/L。转化48 h后，圆柚酮含量增加(67.29±5.07 mg/L)；转化72 h后，圆柚酮含量略有下降(59.15±9.81 mg/L)。每个时间段都没有检测出二氢香芹醇，且(+)-二氢香芹酮的含量相比菌株3检测出的更高，推测二氢香芹醇被完全氧化生成(+)-二氢香芹酮。

对于菌株9，在最初的24 h，主要产物有α-松油醇、(+)-二氢香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯、β-紫罗酮、圆柚酮，目标产物圆柚酮含量为50.95±7.86 mg/L。转化48 h后，圆柚酮含量增加(74.24±8.80 mg/L)；转化72 h后，圆柚酮含量略有下降(66.43±21.26 mg/L)，其他大部分产物含量随转化时间延长有所减少。

对于菌株14，在最初的24 h，主要产物有α-松油醇、(+)-二氢香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、β-紫罗酮、圆柚酮，目标产物圆柚酮含量为64.77±3.08 mg/L。转化48 h后，圆柚酮含量增加(77.55±11.77 mg/L)；转化72 h后，圆柚酮含量略有下降(76.03±7.16 mg/L)，含量趋于稳定，其他产物含量变化不大。

2.4 菌株形态及生理生化特征鉴定

筛选所得的菌株为杆状，为革兰氏阴性菌，在平板上36 ℃培养 24 h，菌落呈圆形光滑状、湿润、边缘整齐、淡黄色、易挑取，在液体培养基中呈浑浊。生理生化实验结果显示，氧化酶实验、明胶液化、葡萄糖、甘露醇和丙二酸盐项目为阳性，淀粉水解、麦芽糖、运动性实验、甲基红实验、V-P实验项目为阴性，这些特征与伯克霍尔德菌属极为相似。

2.5 系统进化发育树的构建

经过16S rDNA序列分析，在NCBI网站上使用Blast比对，将获得菌株的16S rDNA序列进行同源性比对，并构建菌株系统发育树。进化树结果(图3)表明，筛选所得的菌株PZQ14为Burkholderiasp.，属于伯克霍尔德菌属，将其命名为Burkholderiasp. PZQ14。

图3 PZQ14菌株和其他菌株之间关系的系统进化树

2.6 单因素试验结果

以菌液的OD600值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制了Burkholderiasp. PZQ14在LB培养基中的生长曲线，如图4所示。在37 ℃、200 r/min的培养条件下，菌株在4 h进入对数生长期，24 h进入稳定期，52 h进入衰亡期。

图4 Burkholderia sp. PZQ14在LB培养基中的生长曲线

不同碳源对Burkholderiasp. PZQ14转化生成圆柚酮的影响如图5所示。由图5可见，不同碳源均能不同程度地促进生物转化生成圆柚酮，其中使用葡萄糖作为碳源时，生物转化生成圆柚酮的转化量最高，达到101.89 mg/L，转化率达到11.07%。因此，选择葡萄糖作为碳源。

图5 不同碳源对Burkholderia sp. PZQ14转化生成圆柚酮的影响

不同氮源对Burkholderiasp. PZQ14转化生成圆柚酮的影响如图6所示。本试验选取的5种氮源里，蛋白胨作为氮源时，生物转化生成圆柚酮的转化量最高，达到251.60 mg/L，转化率为27.35%，其他氮源的转化效果相差不大。因此，选择蛋白胨作为氮源。

图6 不同氮源对Burkholderia sp. PZQ14 转化生成圆柚酮的影响

不同金属离子对Burkholderiasp. PZQ14转化生成圆柚酮的影响如图7所示。由图7可见，各金属离子的添加都会导致圆柚酮的产量有不同程度的增加，尤其是Fe2+，说明Fe2+的添加对于其转化具有明显的促进作用。因此，选择Fe2+添加到发酵培养基中。

图7 不同金属离子对Burkholderia sp. PZQ14转化生成圆柚酮的影响

2.7 响应面模型建立与显著性检验

响应面设计试验结果见表3。将表3中的数据利用Design-Expert 8.0软件进行分析，建立葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、Fe2+(C)与圆柚酮转化量(Y)的回归模型如下：

Y=117.56+11.05A-20.10B+13.65C-8.22AB+82.16AC-5.35BC+74.58A2+86.72B2+39.24C2。显著性检验结果见表4。

表3 响应面设计方案及结果 Table 3 Box-Behnken experimental design and results

表4 响应面试验方差分析 Table 4 Analysis of variance for the Box-Behnken experiment

对模型进行方差分析，结果见表4。由表4可见，回归模型极显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P=0.057 9>0.05)，说明失拟因素不存在。根据回归方程系数(R2=0.982 7)可判断出，该模型与实际情况具有较好的拟合度。P值和F值的大小在某种程度上可以作为判断各因素对响应值的影响作用强弱的参照，由此可得出影响圆柚酮转化量的强弱关系依次为：蛋白胨(B)> FeSO4(C)>葡萄糖(A)。

根据模型得到的最佳培养基成分为：葡萄糖37.64 g/L、蛋白胨24.86 g/L、FeSO40.60 g/L，此条件下，圆柚酮转化量为332.414 mg/L。参考实际操作，将优化后的培养基组分调整为：葡萄糖38 g/L、蛋白胨25 g/L、FeSO40.60 g/L，在此条件下进行3次验证试验，圆柚酮转化量为328.69±17.88 mg/L，与预测值非常接近，说明该回归模型能较好预测培养基最佳成分，所得优化后的试验因素参数组合有较强的可行性。

3 讨 论

已有研究报道瓦伦西亚橘烯转化生成圆柚酮的过程分为两步，具体为：细胞色素P450酶区域选择性地催化瓦伦西亚橘烯烯丙基C2-羟基化，产生中间产物顺式和反式-圆柚醇，随后这2种醇被非选择性醇脱氢酶(ADH)进一步氧化为圆柚酮[14]。

目前有多项研究利用细菌、真菌以及生物组织等将瓦伦西亚橘烯转化生成圆柚酮。Palmerin-Carreno等[15]利用解脂耶氏酵母2.2ab实现了瓦伦西亚橘烯到圆柚酮的生物转化，圆柚酮产量约为773 mg/L，生物转化率和体积生产率达到82.3%和8.06 mg/ (L·h)，然而要运用到实际工业化生产还存在一定限制。利用生物酶进行生物转化具有高效性和专一性，Girhard等[16]发现枯草芽孢杆菌的细胞色素CYP109B1能催化瓦伦西亚橘烯的氧化，生成圆柚醇和圆柚酮，并通过建立水-有机溶剂两相系统，使圆柚醇和圆柚酮产量达到94 mg/L，占总产物的97%。现有研究利用生物酶来生产圆柚酮的转化量及转化率都较低，本研究旨在筛选出圆柚酮高转化量的菌株，通过条件优化以及对转化机制的研究进一步提高圆柚酮的产量，为工业化生产圆柚酮提供理论基础。

研究首先测得菌株在基础培养基中的生长曲线，选取生长良好的菌株富集培养后加入底物瓦伦西亚橘烯转化72 h，以测得圆柚酮的含量为指标，选取圆柚酮转化量高的菌株进行下一步试验。利用SPME-GC-MS技术，对筛选所得菌株转化瓦伦西亚橘烯生成的产物种类及含量进行测定与分析。对所筛菌株进行菌种鉴定，确定其属于伯克霍尔德菌属，将其命名为Burkholderiasp. PZQ14。本研究以前体物质瓦伦西亚橘烯作为唯一碳源，初筛过程中即可以去掉不符合要求的菌株，大大缩短了菌种筛选的工作量；随后再以圆柚酮产量为指标，缩小筛选范围。这种菌种筛选方式具有高度专一性，快速高效，工作量小，提高了筛菌效率。

随后通过单因素试验，确定了生物转化培养基碳源、氮源及金属离子种类。对于碳源，试验结果显示，葡萄糖作为碳源时对转化生成圆柚酮具有更明显的促进作用。李纪顺等[17]采用均匀设计试验探讨了不同碳源对越南伯克霍尔德氏菌B418生长的影响，结果也显示葡萄糖对菌株生长的影响最大。对于氮源，试验结果选择了蛋白胨作为最佳氮源，这与林仙菊等[18]的试验结果相符。同时，在研究不同金属离子种类对生物转化效率的影响时发现，添加Fe2+相比于添加Mg2+，圆柚酮的转化量提高了186 mg/L，这可能是因为在瓦伦西亚橘烯转化生成圆柚酮这一代谢过程中，细胞色素P450酶是起主要作用的，而CYP450酶系的成员都含有铁血红素和半胱氨酸组合的活性中心[19]，因此Fe2+的添加对其转化具有显著的促进作用。此试验结果也从侧面证明，Burkholderiasp. PZQ14中含有的细胞色素P450酶可能对瓦伦西亚橘烯转化生成圆柚酮起到了关键作用。

在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，确定最佳培养基组分为：38 g/L葡萄糖、25 g/L蛋白胨、0.60 g/L FeSO4，在此条件下进行3次验证试验，圆柚酮转化量为328.69±17.88 mg/L，相比LB培养基，圆柚酮转化量提高了251 mg/L，与Girhard等[16]所得到的94 mg/L的圆柚酮产量相比，提高了234.69 mg/L。另外，菌株生物转化生成圆柚酮的转化效率还受多种因素影响，包括添加底物的时间、底物浓度、转化时间、助溶剂种类及浓度、培养温度和转速等，后续还可以对这些转化条件进行优化，以进一步提高圆柚酮的产量。

伯克霍尔德菌属是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌，已有多项研究证明该菌属表现出多种酶活性。Wu等[20]研究发现菌株BurkholderiacepaciaGS3C中的细胞色素P450单加氧酶对十六烷生物降解活性具有显著的促进作用；Matsuda等[21]从热带泥炭分离出1株Burkholderiasp. KTC-1，该菌在酸性条件下以(+)-儿茶素为唯一碳源生长，并通过菌体中(+)-儿茶素羟化酶和白花青素脱氢酶的作用，将(+)-儿茶素生物转化为花旗松素。而本研究则利用伯克霍尔德菌属，实现了瓦伦西亚橘烯到圆柚酮的生物转化，也为伯克霍尔德菌属生物催化功能研究提供了参考。

后续可以对Burkholderiasp. PZQ14的基因组进行测序，通过基因组注释与分析，了解菌株的生物学特性，并筛选可能参与瓦伦西亚橘烯代谢的相关基因，再对其基因功能进行研究。此外，还可以对瓦伦西亚橘烯生物转化过程中起关键作用的酶进行分离纯化，为了解圆柚酮的生物合成及其相关酶的研究提供新的途径。