酸化剂及其衍生物与植物精油复合对常见致病菌体外抑菌效果研究

苏皓瑀，刘春海，韩建林，陶春卫，李 伟，董秀君

（辽宁菲迪饲料科技有限责任公司，辽宁 兴城125100）

酸化剂是一种环保型饲料添加剂，无残留、无耐药性、无不良作用，具有抑菌效果，可通过提高消化酶的活性有效降低饲料在消化道中的pH值，从而改善营养物质的消化利用，促进动物生长。尚秀国等[1]研究表明，甲酸、富马酸等对标准大肠杆菌（ATCC25922）、标准沙门氏菌（ATCC9120）、标准金黄色葡萄球菌（ATCC6538）的抑菌活性强。酸化剂具体分为两大类，包括H3PO4、HCl及H2SO4等无机酸化剂，以及丁酸、柠檬酸、富马酸等有机酸化剂。无机酸化剂的添加量难以把控，易损害器械。而有机酸化剂有良好的适口性，且可在体内循环发挥良好作用，因此，有机酸在动物生产中的应用研究日趋普遍[2-6]。

植物精油作为一个潜在的抗生素替代物，可以抑制有害菌的生长繁殖，甚至可直接杀死有害菌，从而达到抗菌作用[7]，同时具有调节肠道菌群结构的作用及提高免疫力、抗氧化等功效[8-11]。因为二者均具有抑菌效果，因此设想二者复合可能效果更佳，故进行试验以验证。由于有机酸的作用机理一致，本试验采用丁酸、月桂酸、辛酸及其衍生物等作为试验材料，采取二倍稀释法，研究不同浓度酸化剂及其衍生物与植物精油复合对4种标准菌即致病性大肠埃希氏菌（BNCC 340977）、肠炎沙门氏菌（BNCC 192094）、产气荚膜梭菌（BNCC 185933）、金黄色葡萄球菌（BNCC 186067）的抑菌效果，从而为其作为抗生素替代品应用于饲料中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 添加剂

植物精油（商品名为净力安Ⅳ），主要成分有香芹酚、百里香酚、肉桂醛；酸化剂及其衍生物（辛酸、单辛酸甘油酯、月桂酸、单月桂酸甘油酯、丁酸和苯甲酸），样品浓度为100 mg·mL-1，辽宁菲迪饲料科技有限责任公司提供。

1.2 试验菌种

致病性大肠埃希氏菌（BNCC 340977）、肠炎沙门氏菌（BNCC 192094）、产气荚膜梭菌（BNCC 185933）、金黄色葡萄球菌（BNCC 186067），均购买自北京北纳创联生物技术研究院。

1.3 主要仪器和培养基

高温灭菌锅（型号为BXM-30R）、恒温培养箱（型号为SPX-250B-Z）、超净工作台（型号为SWCJ-2FD）、厌氧培养箱等（型号为HYQX-I）；营养肉汤、营养琼脂、液体硫乙酸盐培养基，均购买自北京北纳创联生物技术研究院。

1.4 菌悬液的制备

取冻存的菌种，接种于装有50 mL营养肉汤液体培养基的三角瓶中，置于37℃摇床中振荡培养18~24 h；取冻存的菌种，接种于装有50 mL液体硫乙醇酸盐培养基的三角瓶中，置于37℃摇床中振荡培养18~24 h。采用平板菌落计数法测定细菌数量，制成1×107~1×108cfu·mL-1的菌悬液。

1.5 最小抑菌浓度（MIC）测定

采用二倍稀释法测定不同浓度酸化剂及其衍生物与植物精油复合对常见菌种的MIC，每个菌种做4组平行。

取11只灭菌试管，按顺序编号，在第1管中加入1.6 mL营养肉汤培养基，其余各管均加入1.0 mL。然后在各个试管中加入添加剂复合物。第1管加入添加剂0.4 mL，混匀后吸出1.0 mL加入到第2管中。同样的方法依次稀释至第11管，弃去1.0 mL，第11管为生长对照组。第1管浓度为10 000μg·mL-1，第2管浓度为5 000μg·mL-1，第3管的浓度为2 500μg·mL-1，以此类推。在第11管中加入0.4 mL乙醇，充分混合后加入1.0 mL菌悬液。用已灭菌的橡胶塞塞住试管口，置于37℃培养箱中培养。

培养24 h后观察各试管的浑浊度，以试管中的培养液出现浑浊为有细菌生长的标志，即以某编号试管以下不再发生明显混浊现象，这一试管的样品浓度为该样品对细菌的MIC。

2 结果与分析

2.1 植物精油与辛酸复合物的抑菌效果

测定植物精油与辛酸不同质量比复合时的MIC，结果见表1。

表1 植物精油与辛酸复合对四种常见菌的MICμg·mL-1

由表1可知，植物精油与辛酸质量比为1∶5时对致病性大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌的MIC为156.250、78.125μg·mL-1。当植物精油质量一定时，随着辛酸质量的增加，对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌的抑菌效果随之升高，但不会一直升高，在植物精油与辛酸质量比为1∶3时效果最好。

2.2 植物精油与单辛酸甘油酯复合的抑菌效果

测定植物精油与单辛酸甘油酯不同质量比复合时的MIC，结果见表2。

表2 植物精油与单辛酸甘油酯复合对四种菌的MICμg·mL-1

由表2可知，植物精油对四种菌的MIC均为312.500μg·mL-1。在植物精油与单辛酸甘油酯质量比为1∶5时对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌的抑菌效果最好。

对肠炎沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌效果不会随单辛酸甘油酯质量的增加而升高，在植物精油与单辛酸甘油酯质量比为1∶3时对肠炎沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌效果最好，MIC分别为156.250、19.530μg·mL-1。

2.3 植物精油与月桂酸复合的抑菌效果

测定植物精油与月桂酸不同质量比复合时的MIC，结果见表3。

表3 植物精油与月桂酸复合对四种菌的MICμg·mL-1

由表3可知，即植物精油∶月桂酸为1∶0时，植物精油对四种菌的MIC均为312.500μg·mL-1，植物精油与月桂酸1∶1复合时，对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌的MIC分别为39.062、312.500μg·mL-1；当植物精油质量一定时，随着月桂酸质量的增加，抑菌效果并没有随之增加。植物精油与月桂酸按质量比1∶3复合时，对致病性大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌的MIC分别为39.062、9.765μg·mL-1，效果较好。

2.4 植物精油与单月桂酸甘油酯复合的抑菌效果

测定植物精油与单月桂酸甘油酯不同质量比复合时的MIC，结果见表4。

表4 植物精油与单月桂酸甘油酯复合对四种菌的MICμg·mL-1

由表4可知，植物精油与单月桂酸甘油酯质量比为1∶3、1∶5时对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希氏菌的抑菌效果相同，植物精油与单月桂酸甘油酯质量比为1∶1、1∶3时对产气荚膜梭菌的抑菌效果相同，单月桂酸甘油酯对肠炎沙门氏菌的抑菌效果并不明显。植物精油与单月桂酸甘油酯复合对金黄色葡萄球菌的MIC为19.530μg·mL-1，对致病性大肠埃希氏菌的MIC为39.062μg·mL-1，对产气荚膜梭菌的MIC为4.88μg·mL-1。

2.5 植物精油与丁酸复合的抑菌效果

测定植物精油与丁酸不同质量比复合时的MIC，结果见表5。

表5 植物精油与丁酸复合对四种菌的MICμg·mL-1

由表5可知，植物精油与丁酸复合对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌的抑菌效果并不明显，抑菌效果并不随着植物精油与丁酸的质量比增加而增加，植物精油与丁酸质量比为1∶2时对致病性大肠杆菌、产气荚膜梭菌的MIC为156.250μg·mL-1。

2.6 植物精油与苯甲酸复合的抑菌效果

测定植物精油与苯甲酸不同质量比复合时的MIC，结果见表6。

表6 植物精油与苯甲酸复合对四种菌的MICμg·mL-1

由表6可知，植物精油与苯甲酸的质量比为1∶0、1∶2时对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌的抑菌效果相同，因此说苯甲酸对三种菌的抑菌效果并不明显。植物精油与苯甲酸在质量比为1∶2时对产气荚膜梭菌的抑菌效果最好，MIC达156.250μg·mL-1。

3 讨论与结论

3.1 单一植物精油与单一酸化剂的抑菌效果

单一植物精油具有抑菌效果，已经被证实。王康莉等[7]的检测结果表明，肉桂醛对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌有抑制作用，其MIC为1 560μg·mL-1，百里香酚对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的MIC为1 560、3 130、1 560μg·mL-1。而韩乾杰等[10]也证实肉桂醛、百里香酚对产气荚膜梭菌具有抑菌效果。甲酸、富马酸等对标准大肠杆菌、标准沙门氏杆菌、标准金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强[1]。

3.2 复合植物精油的抑菌效果

根据前人试验结果，笔者认为酸化剂复合植物精油具有协同作用，由试验结果得知，复合植物精油对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度为312.500μg·mL-1，由此可知，酸化剂与植物精油之间存在协同作用。

3.3 植物精油和酸化剂复合的抑菌效果

植物精油与辛酸、单辛酸甘油酯、月桂酸、单月桂酸甘油酯组成的复合植物精油对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌效果比单独的植物精油更强，而植物精油与苯甲酸的复合对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌的抑菌效果并不明显，植物精油与丁酸复合对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌抑菌效果并不明显。