实时荧光定量PCR 在沙眼衣原体检测中的应用

宁继伟

（大同市第三人民医院 检验科，山西 大同 037046）

0 引言

沙眼衣原体（Chlamydia Trachomatis，CT）作为一种能够通过细菌滤器的微生物，不仅会引发眼部感染，还会引起性病淋巴肉芽肿、生殖泌尿系统感染及其他器官疾病，严重影响患者的身心健康[1-2]。传统的细胞培养技术是检测沙眼衣原体感染的有效方法，具有敏感性高、特异度高的优点，但存在耗时长、对实验室条件要求高、成本高等不足。常规金标法是当前诊断沙眼衣原体感染的常用方法，但敏感性较低，影响检测结果的准确性。随着分子生物学技术的不断进步和发展，实时荧光定量PCR（RT-PCR）在衣原体检测中得到了逐步应用和推广[3]。本实验运用RT-PCR法和金标法检测生殖道分泌物CT，并将两种方法的结果进行比较分析，为RT-PCR在CT检测中的优势提供可靠的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料。选取2019年1月至2020年1月本院接诊的198例疑似沙眼衣原体感染患者。纳入标准：①经临床检查初步怀疑为沙眼衣原体患者；②均行金标法、RT-PCR检测；③患者同意配合研究。排除标准：①内分泌系统疾病；②血液系统疾病；③精神异常、认知功能障碍、语言表达能力障碍等无法配合研究的病人；④妊娠或哺乳期女性。其中男106例，女92例；年龄23～74岁，平均（47.25±7.89）岁。患者均签署知情同意书。

1.2 方法

（1）主要仪器和试剂：ABI 7500荧光PCR扩增仪、沙眼衣原体核酸扩增荧光检测试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司）；沙眼衣原体抗原检测试剂盒（杭州艾康生物技术有限公司）。

（2）检测方法：采集前均清洁外生殖器，男性患者可将按摩后的前列腺液置于无菌密闭容器后送检；女性患者非月经期可用无菌棉拭子在尿道口擦拭停留10 s，置于无菌密闭容器后送检。每位患者均采集3份标本：①RT-PCR：无菌密闭容器中加入1 mL无菌生理盐水，振荡混匀后转移至1.5 mL离心管内，12000 r/min，离心10 min，弃上清液，加入50 μL DNA提取液，振荡均匀，100℃ 10 min，12000 r/min，离心5 min，取上清液5 μL作为DNA反应模板进行RT-PCR。反应条件如下，93℃ 5 min预变性，再按照93℃ 45 s、55℃ 45 s共进行40个循环。反应结束后由计算机分析结果，荧光强度＞5×102copies/mL即可判断为阳性[4]；②金标法：将采集到分泌物的棉拭子放入样品处理管内，按照试剂盒说明书处理标本完成抗原提取。取5滴提取液滴加至抗原检测卡样品窗口内，15 min后观察检测结果；相同方法采用热灭活沙眼衣原体作为阳性对照。如控制窗和结果窗均可见红线即可判断为阳性；控制窗有一条红线、结果窗无红线者为阴性；控制窗无红线则判断为无效，需重新进行检测[5]。

1.3 观察指标。①以细胞培养法为参照，比较常规金标法、RT-PCR两种检查方法在沙眼衣原体检测中的结果；②评价常规金标法、RT-PCR两种方法检测沙眼衣原体的效能，包括准确性、敏感性、特异性、漏诊率和误诊率，敏感性=真阳性/（真阳+假阴性），特异性=真阴/（真阴+假阳性），准确性=（真阳+真阴）/总数，漏诊率=假阴性/（真阳+假阴性），误诊率=假阳性/（真阴+假阳性）。

1.4 统计学分析。采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析，计量资料（±s）表示，采用t检验；计数资料（n，%）表示，采用χ2检验。P＜0.05，表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR与常规金标法在沙眼衣原体检测中的结果比较。根据细胞培养结果可知，198例疑似沙眼衣原体感染者中检出沙眼衣原体感染患者73例，未感染患者125例，以此为参照。RT-PCR与常规金标法检测沙眼衣原体的结果见表1。

表1 RT-PCR与常规金标法在沙眼衣原体检测中的结果比较

2.2 RT-PCR与常规金标法检测沙眼衣原体的效能评价。由表2可知，RT-PCR诊断沙眼衣原体感染的敏感性、特异性、准确性均高于金标法，漏诊率、误诊率均低于金标法。

表2 RT-PCR与常规金标法检测沙眼衣原体的效能评价（%）

3 讨论

沙眼衣原体是引起尿道炎、直肠炎、宫颈炎、盆腔炎、输卵管炎等疾病的常见病原体，部分沙眼衣原体感染患者缺乏明显的临床症状，导致患者延误治疗时机，影响预后。临床中快速、准确的诊断沙眼衣原体感染是控制疾病传播、减少不良后果的关键[6]。常规金标法在沙眼衣原体检测中应用广泛，具有无需使用特殊设备、操作简便的优势，但检测敏感性较低，容易出现漏诊情况。因此有必要采用更加准确的检测方法来弥补常规方法的不足。实时荧光定量PCR是上世纪末发展起来的一种全新检测技术，融汇了PCR高敏感性、荧光光谱技术高精确定量、分子杂交技术高特异性等方面的优势，在沙眼衣原体的早期诊断中具有较高的应用价值[7]。

本研究结果显示，RT-PCR检测沙眼衣原体感染的准确性为98.48%，特异性为99.20%，敏感性为97.26%，均高于常规金标法的检测结果；而前者的漏诊率为2.74%，误诊率为0.80%，均低于后者的检测结果，说明RT-PCR在沙眼衣原体检测中可为临床医师提供更加准确的参考依据。目前，沙眼衣原体感染的诊断主要依赖于实验室检测结果，通常以细胞培养作为诊断沙眼衣原体感染的金标准，但操作程序较为复杂、耗时，容易延误患者病情。金标法尽管操作简单、快速，但待测标本中需包含足量的衣原体抗原方可获得可靠的检测结果，容易出现漏诊情况，而RT-PCR检测能够在全封闭环境下操作，实现快速、准确鉴别出病原体的效果，避免污染造成的假阳性问题。在RT-PCR实际过程中，特异性引物通过荧光基团来标记，在单管封闭的条件下进行PCR扩增和产物分析的全过程，通过计算机进行实时动态检测PCR扩增产物并对结果自动分析，可对病原体感染和临床治疗效果进行准确反映，具有重复性好、敏感性高、特异性强、直观、易操作的优点。结合本次实验发现，金标法在应用中可能受污染因素、受检者自身疾病等因素的干扰，出现假阳性情况，干扰检测结果。而RT-PCR法检测能够减少人为操作对检测结果的干扰，避免了金标法在检测过程中易产生污染的不足，并克服了金标法检测存在“窗口期”的问题，能够更加灵敏地反映沙眼衣原体感染情况，减少漏诊、误诊率。本文中RT-PCR漏诊2例，误诊1例，常规金标法漏诊17例，误诊18例，充分证实了这一观点。值得注意的是，RTPCR法也存在对检测环境、实验设备的要求较高、实验成本较贵等方面的不足。

综上所述，与常规金标法比较，RT-PCR法能够更加灵敏地检出沙眼衣原体感染者，敏感性、特异性、准确性均高于金标法，可为临床医师对于沙眼衣原体感染者的筛查提供更加准确、可靠的参考依据，具有重要的临床应用与推广价值。